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免疫组化故障排除指南

发布日期:2013-01-22  浏览次数:1893  

免疫组化故障排除指南

  • 问题一:信号弱/无信号
  • 原因 解决方案
    组织处理 组织处理过程中抗原可能已经被破坏。
    免疫染色前,确保组织的正确处理。使用适当的固定剂、固定时间、包埋试剂和包埋技术。使用适当的切片设备和技术。免疫组化所用的组织切片厚度建议为4um。对于福尔马林固定的石蜡包埋组织,确保切片完全脱蜡和水化。需要时,请更换新的二甲苯和酒精。
    抗原修复(表位释放) 确定最佳的抗原修复条件。尝试不经抗原修复,直接进行组织切片的染色。
    使用抗原热修复法(HIER)。调试并维持特定的温度。调节pH值(选用合适的缓冲液)。调整加热时间。
    使用抗原酶修复法(EIER)。选用合适的酶(如蛋白酶K)。调整孵育时间。在室温或加热的条件下进行抗原修复。
    一抗 按照说明书的要求准备抗体。
    抗体开瓶前离心。
    抗体重悬后,离心去除任何可能的聚集物。
    抗体分装、冻存于-20℃。避免反复冻融。
    在有效期内使用抗体。
    增加抗体的浓度。
    延长孵育时间(如抗体4℃过夜)。
    二抗 针对一抗,选用合适的二抗或检测系统。
    增加二抗的浓度和孵育时间。
    检测系统 使用合适的检测系统。
    确保酶和底物相匹配(如DAB底物需要与HRP酶配合使用)。
    试剂使用顺序要正确。
    进行适当的清洗。
    在室温使用显色组分。
    在有效期内使用显色组分。
    使用检测放大系统,如Polymer检测法或酪胺信号放大技术。直标法检测的放大作用小,可能导致信号轻度弱。
    叠氮钠是HRP酶的抑制剂,在某些试剂,如HRP标记的二抗中存在时可能会干扰染色结果。其它试剂中存在的少量叠氮钠不会影响免疫染色结果。
    抗原 待测抗原可能不存在于特定的组织中,或者抗原的表达水平太低而无法检测出。
    在组织处理或抗原修复期间,抗原表位可能受到破坏。如果单克隆抗体所针对的特定的抗原表位被掩盖或破坏,使用该单抗进行染色,则无信号。应该重新染色或处理新的组织样本。
    使用其他实验方法来检测抗原是否存在(如原位杂交法)。
    显色底物 调整孵育时间。检查底物是否出现沉淀。
    对不同的底物,选用合适的封片剂,(比如,可使用永久封片剂封固DAB染色的玻片,而不溶于酒精的AEC底物则需要使用水溶性封片剂)。
  • 问题二:过度染色
  • 原因 解决方案
    组织处理 免疫染色前,确保组织的正确处理。使用适当的固定剂、固定时间、包埋试剂和包埋技术。使用适当的切片设备和技术。免疫组化所用的组织切片厚度建议为4um。对于福尔马林固定的石蜡包埋组织,确保切片完全脱蜡和水化。需要时,请更换新的二甲苯和酒精。
    抗原修复 组织可能被过度修复。调整孵育时间、温度。如必要,使用其他抗原修复方法。尝试不经抗原修复,直接进行组织切片的染色。
    一抗 按照说明书的要求准备抗体。
    抗体开瓶前离心。
    抗体重悬后,离心去除任何可能的聚集物。
    抗体分装、冻存于-20℃。避免反复冻融。
    在有效期内使用抗体。
    降低抗体浓度,调整抗体的孵育时间。
    在组织样本与蛋白封闭液共同孵育后,立即加入一抗进行孵育。
    二抗 调整二抗的浓度。使用不易出现非特异性结合的二抗(如交叉吸附的抗体或F(ab')2片段抗体)。
    检测系统 使用不易出现非特异结合的检测系统。
    调整孵育时间。
    非特异性结合 封闭内源性分子和高电荷分子。
    内源性分子 某些类型的组织和染色过程中,可能会存在内源性分子并影响染色。请为各种类型的组织确定必要的封闭步骤,例如,封闭内源性分子(包括内源性生物素、内源性过氧化物酶和内源性磷酸酶)或Fc受体等。
    如果内源性分子很难被彻底封闭,请选用其它染色方法(例如,在富含生物素的肝脏上采用非生物素检测法)。
    蛋白封闭液 使用来自二抗宿主动物的蛋白封闭液或血清封闭液,以防止非特异性结合(抗体为高电荷蛋白质,其分子的疏水性可能导致非特异性染色)。
    在一抗孵育之前,先将组织样本与蛋白封闭液共同孵育。
    清洗不充分 增加清洗时间和/或清洗次数。根据不同的染色系统使用具有适当pH值的缓冲液(如PBS或Tris清洗缓冲液)。添加Tween-20等去污剂,以降低疏水相互作用。
    显色底物 调整孵育时间。如果可能的话,调整显色底物的浓度。检查是否出现沉淀,切勿使用过期产品。
    组织切片变干 在免疫染色过程中,不要让组织切片变干。组织孵育期间,请使用湿盒和足量的试剂。使用PAP免疫组化笔在组织切片周围画出一圈疏水屏障,以确保组织始终被试剂覆盖。
  • 问题三:其他问题
  • 原因 解决方案
    试剂过期 在免疫染色过程中,检查所有试剂的有效期。
    对照 确保阳性对照、阴性对照有效。
    表面活性剂清洗 增加表面活性剂清洗的步骤,以增强试剂的穿透能力(例如在PBS中加入0.2% Triton X-100)。
    封片剂 为每种显色底物选用适当的封片剂(不同的显色底物可能需要水溶性或非水溶性封片剂)。
    衬染 使用合适的衬染时间。
    自动染色 检查机器,确保参数正确。
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