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Western Blot常见问题及解决方案2
发布日期：2013-01-21 浏览次数：4667
Western Blot常见问题及解决方案2
| 原因 | 解决方案 |
| 蛋白质含量不足 | 增加样本中的蛋白质含量。 |
| 通过其他方法确认样本中是否存在蛋白质。 | |
| 凝胶电泳时间过长 | 减少凝胶电泳时间。观察凝胶中染料前端的位置，确保当染料前端接近凝胶底部时断开电源。 |
| 样本陈旧或其中的蛋白已降解 | 测试含目标蛋白的新鲜样本。 |
| 蛋白转膜过度或未正确转膜 | 使用孔径较小的膜。 |
| 对于低分子量（小于10KDa）的蛋白质，降低转膜电压。 | |
| 优化转膜时间，转膜时间与蛋白分子量大小密切相关。 | |
| 正确安装“三明治夹层”，保证凝胶与膜之间充分接触；确保使用正确的转膜缓冲液。 | |
| 使用硝酸纤维素膜时，转膜时存在SDS，会降低蛋白与膜之间的结合。 | |
| 在转膜缓冲液中加入20%的甲醇，会增加蛋白与膜的结合能力。 | |
| 使用可逆性染色液（如丽春红）染膜，以显示主要条带，从而检查蛋白质的转膜情况。 | |
| 蛋白质被封闭液遮盖 | 换用其他封闭液。 |
| 调整封闭液中的蛋白质浓度，建议使用含3%脱脂干奶粉的蒸馏水（dH2O）溶液。 | |
| 存在酶抑制剂（如叠氮化物） | 确保缓冲液中不含叠氮钠，否则将影响HRP活性。 |
| 一抗陈旧或降解 | 确保抗体在有效期范围之内。 |
| 尽量避免抗体反复冻融，可能会影响抗体的结构以及蛋白与抗体之间的结合。 | |
| 一抗和/或二抗的量不够 | 查看生产厂商的抗体推荐浓度。 |
| 做浓度梯度，以摸索最佳浓度。 | |
| 用错一抗 | 确保一抗的反应种属性正确（如要检测人VEGF，则应使用兔抗人的VEGF抗体作为一抗）。 |
| 用错二抗 | 确保使用的二抗是针对一抗来源种属的抗体（如一抗为兔抗人VEGF，那么二抗需用驴抗兔）。 |
| 一抗孵育时间不足 | 增加一抗的孵育时间。抗体可在室温孵育1小时以上或在4℃孵育过夜。 |
| 二抗孵育时间不足 | 适当增加二抗的孵育时间。 |
| 洗膜过度 | 缩短洗膜时间和/或减少洗膜次数。 |
| 使用不含去污剂或去污剂浓度较低的清洗缓冲液。 | |
| 显色剂不对 | 确保使用的显色试剂与酶标记物相配。 |
| 确保遵循生产厂商的说明正确配制底物。 | |
| 盐含量过高 | 降低清洗缓冲液中的盐含量。 |
| 降低抗体稀释缓冲液中的盐含量。 | |
| 显色剂降解/错误 | 确保显色剂的配制方法无误。 |
| 检查显色剂是否仍有活性。 | |
| 对于ECL方法，胶片不好/过期 | 确保胶片未过期或曝光。 |
| 对于ECL方法，ECL显色液陈旧/过期 | 使用新鲜的ECL显色液。 |
| 对于ECL方法，胶片曝光时间太短 | 延长胶片的曝光时间。 |
| 对于ECL方法，保鲜膜影响显色反应 | 换用其他品牌的保鲜膜。 |
| 原因 | 解决方案 |
| 抗体浓度过高 | 查看生产厂商对一抗/二抗的推荐工作浓度 |
| 做一系列浓度梯度，摸索最佳条件。 | |
| 抗体孵育时间过长 | 确保采用正确的孵育时间和温度。 |
| 抗体的非特异性结合 | 确保一抗仅对目标蛋白具有特异性。 |
| 省略一抗孵育步骤进行质控，若仍出现目的条带，请选用其他二抗。 | |
| 使用其他种属来源的二抗。 | |
| 抗体与封闭液和/或样本中的蛋白发生交叉反应 | 使用其它封闭液配方。 |
| 比如山羊抗体可轻微识别牛的蛋白质，因此山羊抗体能与BSA（牛血清白蛋白）发生交叉反应，将导致膜上出现紫色光泽。这种情况请使用其它种属来源的抗体或其它封闭液。 | |
| 如果怀疑二抗有问题，请使用含1-5%正常血清（来自与目的蛋白相同的种属）的缓冲液稀释抗体。 | |
| 封闭液无效 | 使用其它封闭液配方。 |
| 在封闭液中加入去污剂，如Tween-20。 | |
| 封闭不充分 | 使用其它封闭液配方。 |
| 该批次的封闭液可能已失效，使用新鲜封闭液。 | |
| 低温可能会降低封闭效率，4℃封闭过夜的效果不一定好。尝试室温封闭一小时，并在封闭液中添加Tween-20。 | |
| 清洗不充分 | 在每个步骤后，洗膜3次，共10分钟。如果还不够充分，适当延长清洗步骤的时间。 |
| 尝试向清洗缓冲液中添加其它去污剂；或者，如果缓冲液中没有任何去污剂，请添加Tween-20。 | |
| 增加清洗缓冲液的用量。 | |
| 与显色底物的孵育时间过长 | 缩短显色溶液的孵育时间。监测显色过程，直至出现条带，然后在蒸馏水中洗膜以终止反应。 |
| 酶过量 | 降低所用酶标记物的浓度。 |
| 受内源性物质的干扰 | 脱脂奶粉中含有内源性生物素，会干扰亲和素/生物素检测系统。这种情况换用其它封闭液，如3%的BSA。 |
| 试剂被污染 | 使用前对缓冲液进行过滤，以去除污染物。 |
| 配制新鲜的缓冲液，并重新进行Western Transfer实验。 | |
| 膜有问题 | 换用新的膜。 |
| 整个实验过程中，仅在转膜与免疫染色交替之间的阶段允许膜变干。一旦开始免疫染色，则在该过程完成之前，不能使膜变干。如果膜在免疫过程中出现干燥，应重新进行Western Transfer实验。 | |
| 对于ECL方法，ECL胶片曝光过度 | 缩短胶片曝光时间。 |
| 如果目标蛋白的信号太强，请等待5-10分钟后重新对胶片进行曝光。 |
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