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Western Blot常见问题及解决方案2

发布日期:2013-01-21  浏览次数:2422  

Western Blot常见问题及解决方案2

  • 问题一:信号弱/无信号
  • 原因 解决方案
    蛋白质含量不足 增加样本中的蛋白质含量。
    通过其他方法确认样本中是否存在蛋白质。
    凝胶电泳时间过长 减少凝胶电泳时间。观察凝胶中染料前端的位置,确保当染料前端接近凝胶底部时断开电源。
    样本陈旧或其中的蛋白已降解 测试含目标蛋白的新鲜样本。
    蛋白转膜过度或未正确转膜 使用孔径较小的膜。
    对于低分子量(小于10KDa)的蛋白质,降低转膜电压。
    优化转膜时间,转膜时间与蛋白分子量大小密切相关。
    正确安装“三明治夹层”,保证凝胶与膜之间充分接触;确保使用正确的转膜缓冲液。
    使用硝酸纤维素膜时,转膜时存在SDS,会降低蛋白与膜之间的结合。
    在转膜缓冲液中加入20%的甲醇,会增加蛋白与膜的结合能力。
    使用可逆性染色液(如丽春红)染膜,以显示主要条带,从而检查蛋白质的转膜情况。
    蛋白质被封闭液遮盖 换用其他封闭液。
    调整封闭液中的蛋白质浓度,建议使用含3%脱脂干奶粉的蒸馏水(dH2O)溶液。
    存在酶抑制剂(如叠氮化物) 确保缓冲液中不含叠氮钠,否则将影响HRP活性。
    一抗陈旧或降解 确保抗体在有效期范围之内。
    尽量避免抗体反复冻融,可能会影响抗体的结构以及蛋白与抗体之间的结合。
    一抗和/或二抗的量不够 查看生产厂商的抗体推荐浓度。
    做浓度梯度,以摸索最佳浓度。
    用错一抗 确保一抗的反应种属性正确(如要检测人VEGF,则应使用兔抗人的VEGF抗体作为一抗)。
    用错二抗 确保使用的二抗是针对一抗来源种属的抗体(如一抗为兔抗人VEGF,那么二抗需用驴抗兔)。
    一抗孵育时间不足 增加一抗的孵育时间。抗体可在室温孵育1小时以上或在4℃孵育过夜。
    二抗孵育时间不足 适当增加二抗的孵育时间。
    洗膜过度 缩短洗膜时间和/或减少洗膜次数。
    使用不含去污剂或去污剂浓度较低的清洗缓冲液。
    显色剂不对 确保使用的显色试剂与酶标记物相配。
    确保遵循生产厂商的说明正确配制底物。
    盐含量过高 降低清洗缓冲液中的盐含量。
    降低抗体稀释缓冲液中的盐含量。
    显色剂降解/错误 确保显色剂的配制方法无误。
    检查显色剂是否仍有活性。
    对于ECL方法,胶片不好/过期 确保胶片未过期或曝光。
    对于ECL方法,ECL显色液陈旧/过期 使用新鲜的ECL显色液。
    对于ECL方法,胶片曝光时间太短 延长胶片的曝光时间。
    对于ECL方法,保鲜膜影响显色反应 换用其他品牌的保鲜膜。
  • 问题二:背景高
  • 原因 解决方案
    抗体浓度过高 查看生产厂商对一抗/二抗的推荐工作浓度
    做一系列浓度梯度,摸索最佳条件。
    抗体孵育时间过长 确保采用正确的孵育时间和温度。
    抗体的非特异性结合 确保一抗仅对目标蛋白具有特异性。
    省略一抗孵育步骤进行质控,若仍出现目的条带,请选用其他二抗。
    使用其他种属来源的二抗。
    抗体与封闭液和/或样本中的蛋白发生交叉反应 使用其它封闭液配方。
    比如山羊抗体可轻微识别牛的蛋白质,因此山羊抗体能与BSA(牛血清白蛋白)发生交叉反应,将导致膜上出现紫色光泽。这种情况请使用其它种属来源的抗体或其它封闭液。
    如果怀疑二抗有问题,请使用含1-5%正常血清(来自与目的蛋白相同的种属)的缓冲液稀释抗体。
    封闭液无效 使用其它封闭液配方。
    在封闭液中加入去污剂,如Tween-20。
    封闭不充分 使用其它封闭液配方。
    该批次的封闭液可能已失效,使用新鲜封闭液。
    低温可能会降低封闭效率,4℃封闭过夜的效果不一定好。尝试室温封闭一小时,并在封闭液中添加Tween-20。
    清洗不充分 在每个步骤后,洗膜3次,共10分钟。如果还不够充分,适当延长清洗步骤的时间。
    尝试向清洗缓冲液中添加其它去污剂;或者,如果缓冲液中没有任何去污剂,请添加Tween-20。
    增加清洗缓冲液的用量。
    与显色底物的孵育时间过长 缩短显色溶液的孵育时间。监测显色过程,直至出现条带,然后在蒸馏水中洗膜以终止反应。
    酶过量 降低所用酶标记物的浓度。
    受内源性物质的干扰 脱脂奶粉中含有内源性生物素,会干扰亲和素/生物素检测系统。这种情况换用其它封闭液,如3%的BSA。
    试剂被污染 使用前对缓冲液进行过滤,以去除污染物。
    配制新鲜的缓冲液,并重新进行Western Transfer实验。
    膜有问题 换用新的膜。
    整个实验过程中,仅在转膜与免疫染色交替之间的阶段允许膜变干。一旦开始免疫染色,则在该过程完成之前,不能使膜变干。如果膜在免疫过程中出现干燥,应重新进行Western Transfer实验。
    对于ECL方法,ECL胶片曝光过度 缩短胶片曝光时间。
    如果目标蛋白的信号太强,请等待5-10分钟后重新对胶片进行曝光。
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