关闭
扫一扫 更精彩
关闭
敏泰元生物 — 细胞与免疫学专业服务平台

Technical Information

| 技术资料
首页 // 技术资料 // ELISA实验注意事项

ELISA实验注意事项

发布日期:2013-01-04  浏览次数:2163  

ELISA实验注意事项

  • 一.ELISA实验所需试剂、器材
    1. 1.试剂
    2. 试剂 配制方法
      包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液) NaCO3 1.59克、NaHCO3 2.93克 ,加蒸馏水至1000ml。
      洗涤缓冲液(PH7.4 PBS) 0.15M KH2PO4 0.2克,Na2HPO4•12H2O 2.9克,NaCl 8.0克,KCl 0.2克,Tween-20 0.05% 0.5ml ,加蒸馏水至1000ml。
      稀释液 牛血清白蛋白(BSA) 0.1克,加洗涤缓冲液至100ml;或以羊血清、兔血清等 血清与洗涤液配成5~10%使用。
      终止液(2M H2SO4) 蒸馏水178.3ml,逐滴加入浓硫酸(98%)21.7ml。
      底物缓冲液(PH5.0磷酸柠檬酸) 0.2M Na2HPO4(28.4克/L) 25.7ml , 0.1M 柠檬酸(19.2克/L) 24.3ml,加蒸馏水50ml。
      TMB(四甲基联苯胺)显色液 TMB(10mg/5ml无水乙醇) 0.5ml,底物缓冲液(PH5.5) 10ml,0.75%H2O2 32μl。
      ABTS显色液 ABTS 0.5mg,底物缓冲液(PH5.5) 1ml,3%H2O2 2μl。
      抗原、抗体和酶标记抗体
      正常血清和阳性对照血清
    3. 目前市场上已经有很成熟的ELISA试剂盒,省去了繁琐的试剂配制过程、大大简化了实验步骤、节省实验者宝贵的时间。
    4. 提供ELISA试剂盒的厂家有很多,比如Merck Millipore、Peprotech、CST、BD等公司。其中,Peprotech推出的MiNi ELISA KIT,大约可分析200 个ELISA 板(如目录号:900-M98 ),比较适合分析量较小的用户。除了蛋白、细胞因子等ELISA检测试剂盒,针对小鼠、人等物种,Merck Millipore有多种细胞因子检测panel。例如(目录号:MPXMCYTO-70K),可同时检测32种细胞因子,并且用户可根据需要,从中挑选、组合自己需要的细胞因子。
    5. 2.器材
    6. 聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40孔或96孔 ELISA检测仪
      50μl及100μl加样器 37℃孵育箱
      洗涤瓶
  • 二.注意事项
    1. 1.应分别以阳性对照与阴性对照控制实验条件,待检样品应分两份,以保证实验结果的准确性。如果本底较高,说明有非特异性反应,可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。
    2. 2.各项实验条件的选择很重要,包括:
    3. (1)固相载体的选择:许多物质可作为固相载体,如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。用等量抗原包被,在同一实验条件下进行反应,观察其显色反应是否均一性,据此判明其吸附性能是否良好。
    4. (2)包被抗体(或抗原)的选择:将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时,一般要求PH在9.0~9.6。吸附温度、时间及蛋白量也有一定影响,多采用4℃ 18~24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定:即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg/ml等)进行包被后,在其它实验条件相同的情况下,观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1~10μg/ml。
    5. 用于ELISA检测的抗体,纯度一定要好。Abcam、Merck Millipore、BD、Peprotech、CST等公司都有高质量的、专门用于ELISA检测的抗体。其中,Abcam公司的抗体较全、Peprotech、CST公司的抗体较专。
    6. (3)酶标记抗体工作浓度的选择:首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定,然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。
    7. (4)酶的底物及供氢体的选择:对供氢体的要求是安全、有明显地显色反应,而本身无色。有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用,应使用不致癌、灵敏度高的供氢体,如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后,应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间,以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制,尤其是H2O2在临用前加入。
    8. 其中,TMB用在HRP系统中,对应的检测波长是450nm。加入HRP结合的二抗孵育后,再加入TMB进行显色。Merck Millipore公司(目录号:613544-100ML、ES022-500ML)和CST公司都有不同规格的TMB(目录号:7004S、7004L)。
    9. ABTS也是HRP的底物之一,对应的检测波长是405nm。ABTS比TMB敏感,显色慢。但是重复实验时比较容易控制显色时间,结果较一致。Merck Millipore公司同样也有两种规格的ABTS(目录号:ES004-100ML、ES004-500ML)。
    www.mintaibio.com