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ELISA常见问题及解决方案

发布日期:2013-01-04  浏览次数:2518  

ELISA常见问题及解决方案

  • 一.背景高或者非特异性染色
  • 原因 解决方案
    抗体的非特异性结合 更换封闭液(例如,使用酪蛋白替代BSA);封闭结束后不要清洗;倒出封闭液,吸水纸上吸干残留液体后直接进行下一步。
    未充分清洗酶标板 确保在清洗过程中每个微孔都充满缓冲液、清洗仪器正常工作。各步骤之间清洗3~5次,不要增加清洗次数。清洗完成后,将酶标板用力按压在纸巾上,以除去残余的缓冲液。清洗溶液中应添加适量的Tween-20(推荐浓度0.01-0.1%)。
    缓冲液被污染 缓冲液应新鲜配制,一周内使用,并过滤除菌。
    孵育温度太高 整个实验过程应在室温25℃。
    孵育时间过长 缩短孵育时间
    酶标记物污染了底物或者阳性对照污染了微孔 吸取不同的试剂时应更换吸头,并使用不同的贮液器。最好用移液器加入或去除清洗缓冲液(倒入/倒出可能导致交叉污染)。
    检测抗体或Avidin-HRP的浓度过高 检测浓度计算是否正确,或者进一步稀释后再使用。
    底物在使用前曝光 在将底物加入到微孔中以前,应始终避光保存
    读取吸光值时使用了错误的滤光片 ABTS为底物时应在405nm波长读取吸光值(TMB为底物时应在450nm波长读取吸光值),并以650nm作为校正波长。
    显色时间过长 每5分钟读取一次吸光值,以监测空白孔的O.D.读数。
  • 二.显色弱或者不显色
  • 原因 解决方案
    遗漏了某种试剂或某个步骤 查看实验方案,严格遵循实验操作步骤。
    清洗缓冲液中的去污剂浓度过高 去除或降低去污剂的浓度,推荐0.01-0.1%
    酶标板未适当清洗 减少各步骤之间的清洗次数,尤其是当未使用全自动或半自动洗板机时,清洗1-2次即可。
    样本中存在酶抑制剂 叠氮钠抑制了过氧化物酶的活性。
    孵育时间或温度错误 孵育期间应将酶标板放在孵育箱(25℃)内,以免出现温度波动
    加入微孔中的底物量有误 检查移液器
    酶-底物系统不合适 Avidin-HRP和ABTS配对使用,Streptavidin和TMB配对使用
    试剂盒内的组分储存不当 按说明书要求储存各组分
    读取吸光值时使用了错误的滤光片 ABTS为底物时应在405nm波长读取吸光值(TMB为底物时应在450nm波长读取吸光值),并以650nm作为校正波长
    原因 解决方案
  • 三.标准曲线不佳
  • 原因 解决方案
    标准品配制有误 使用推荐的稀释缓冲液对标准品进行稀释
    过早稀释 使用前再配制各种试剂,并尽快使用
    捕获抗体无法包被 使用适合做ELISA的板,不能用细胞培养板
    清洗不充分 每个微孔中应加入等体积清洗液,确保所有微孔均可被抽吸干净,并及时填充。
    移液出错 校正移液器,快速、等量的将移液器中的试剂沿微孔的侧壁加入
    显色时间过长 空白孔的O.D.读数不超过0.2或最高浓度标准品孔的O.D.读数不超过1.2。
    试剂盒内的组分储存不当 按说明书要求储存各组分,不要将重悬后的试剂在室温放置时间过长。
  • 问题 原因 解决方案
    精确度较差 试剂混合不充分 移液前,充分混合试剂
    清洗不充分 每个微孔中应加入等体积清洗液,确保所有微孔均可被抽吸干净,并及时填充。
    移液出错 校正移液器,快速、等量的将移液器中的试剂沿微孔的侧壁加入
    耗材重复使用 吸取不同样本时应更换吸头;不同的试剂使用不同的贮液器;个孵育时段内应用新的密封片封板。
    微孔被吸头或洗板机划伤 吸液、加液时小心操作
    样本中存在沉淀物 使用前应离心样本管
    微孔不干净或存在污垢 使用前仔细检查微孔,并清除污垢。读取吸光值前,请擦拭酶标板的底部,以去除污垢或指纹。
    边缘效应 蒸发 每个孵育步骤都应使用密封片封板
    温度不均匀 孵育期间应将酶标板放在孵育箱(25℃)内,以免温度波动,请勿堆叠酶标板。
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