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免疫组化故障排除指南
发布日期：2013-01-22 浏览次数：3985
免疫组化故障排除指南
| 原因 | 解决方案 |
| 组织处理 | 组织处理过程中抗原可能已经被破坏。 |
| 免疫染色前，确保组织的正确处理。使用适当的固定剂、固定时间、包埋试剂和包埋技术。使用适当的切片设备和技术。免疫组化所用的组织切片厚度建议为4um。对于福尔马林固定的石蜡包埋组织，确保切片完全脱蜡和水化。需要时，请更换新的二甲苯和酒精。 | |
| 抗原修复（表位释放） | 确定最佳的抗原修复条件。尝试不经抗原修复，直接进行组织切片的染色。 |
| 使用抗原热修复法（HIER）。调试并维持特定的温度。调节pH值（选用合适的缓冲液）。调整加热时间。 | |
| 使用抗原酶修复法（EIER）。选用合适的酶（如蛋白酶K）。调整孵育时间。在室温或加热的条件下进行抗原修复。 | |
| 一抗 | 按照说明书的要求准备抗体。 |
| 抗体开瓶前离心。 | |
| 抗体重悬后，离心去除任何可能的聚集物。 | |
| 抗体分装、冻存于-20℃。避免反复冻融。 | |
| 在有效期内使用抗体。 | |
| 增加抗体的浓度。 | |
| 延长孵育时间（如抗体4℃过夜）。 | |
| 二抗 | 针对一抗，选用合适的二抗或检测系统。 |
| 增加二抗的浓度和孵育时间。 | |
| 检测系统 | 使用合适的检测系统。 |
| 确保酶和底物相匹配（如DAB底物需要与HRP酶配合使用）。 | |
| 试剂使用顺序要正确。 | |
| 进行适当的清洗。 | |
| 在室温使用显色组分。 | |
| 在有效期内使用显色组分。 | |
| 使用检测放大系统，如Polymer检测法或酪胺信号放大技术。直标法检测的放大作用小，可能导致信号轻度弱。 | |
| 叠氮钠是HRP酶的抑制剂，在某些试剂，如HRP标记的二抗中存在时可能会干扰染色结果。其它试剂中存在的少量叠氮钠不会影响免疫染色结果。 | |
| 抗原 | 待测抗原可能不存在于特定的组织中，或者抗原的表达水平太低而无法检测出。 |
| 在组织处理或抗原修复期间，抗原表位可能受到破坏。如果单克隆抗体所针对的特定的抗原表位被掩盖或破坏，使用该单抗进行染色，则无信号。应该重新染色或处理新的组织样本。 | |
| 使用其他实验方法来检测抗原是否存在（如原位杂交法）。 | |
| 显色底物 | 调整孵育时间。检查底物是否出现沉淀。 |
| 对不同的底物，选用合适的封片剂，（比如，可使用永久封片剂封固DAB染色的玻片，而不溶于酒精的AEC底物则需要使用水溶性封片剂）。 |
| 原因 | 解决方案 |
| 组织处理 | 免疫染色前，确保组织的正确处理。使用适当的固定剂、固定时间、包埋试剂和包埋技术。使用适当的切片设备和技术。免疫组化所用的组织切片厚度建议为4um。对于福尔马林固定的石蜡包埋组织，确保切片完全脱蜡和水化。需要时，请更换新的二甲苯和酒精。 |
| 抗原修复 | 组织可能被过度修复。调整孵育时间、温度。如必要，使用其他抗原修复方法。尝试不经抗原修复，直接进行组织切片的染色。 |
| 一抗 | 按照说明书的要求准备抗体。 |
| 抗体开瓶前离心。 | |
| 抗体重悬后，离心去除任何可能的聚集物。 | |
| 抗体分装、冻存于-20℃。避免反复冻融。 | |
| 在有效期内使用抗体。 | |
| 降低抗体浓度，调整抗体的孵育时间。 | |
| 在组织样本与蛋白封闭液共同孵育后，立即加入一抗进行孵育。 | |
| 二抗 | 调整二抗的浓度。使用不易出现非特异性结合的二抗（如交叉吸附的抗体或F(ab')2片段抗体）。 |
| 检测系统 | 使用不易出现非特异结合的检测系统。 |
| 调整孵育时间。 | |
| 非特异性结合 | 封闭内源性分子和高电荷分子。 |
| 内源性分子 | 某些类型的组织和染色过程中，可能会存在内源性分子并影响染色。请为各种类型的组织确定必要的封闭步骤，例如，封闭内源性分子（包括内源性生物素、内源性过氧化物酶和内源性磷酸酶）或Fc受体等。 |
| 如果内源性分子很难被彻底封闭，请选用其它染色方法（例如，在富含生物素的肝脏上采用非生物素检测法）。 | |
| 蛋白封闭液 | 使用来自二抗宿主动物的蛋白封闭液或血清封闭液，以防止非特异性结合（抗体为高电荷蛋白质，其分子的疏水性可能导致非特异性染色）。 |
| 在一抗孵育之前，先将组织样本与蛋白封闭液共同孵育。 | |
| 清洗不充分 | 增加清洗时间和/或清洗次数。根据不同的染色系统使用具有适当pH值的缓冲液（如PBS或Tris清洗缓冲液）。添加Tween-20等去污剂，以降低疏水相互作用。 |
| 显色底物 | 调整孵育时间。如果可能的话，调整显色底物的浓度。检查是否出现沉淀，切勿使用过期产品。 |
| 组织切片变干 | 在免疫染色过程中，不要让组织切片变干。组织孵育期间，请使用湿盒和足量的试剂。使用PAP免疫组化笔在组织切片周围画出一圈疏水屏障，以确保组织始终被试剂覆盖。 |
| 原因 | 解决方案 |
| 试剂过期 | 在免疫染色过程中，检查所有试剂的有效期。 |
| 对照 | 确保阳性对照、阴性对照有效。 |
| 表面活性剂清洗 | 增加表面活性剂清洗的步骤，以增强试剂的穿透能力（例如在PBS中加入0.2% Triton X-100）。 |
| 封片剂 | 为每种显色底物选用适当的封片剂（不同的显色底物可能需要水溶性或非水溶性封片剂）。 |
| 衬染 | 使用合适的衬染时间。 |
| 自动染色 | 检查机器，确保参数正确。 |