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ELISA实验注意事项
发布日期：2013-01-04 浏览次数：4144
ELISA实验注意事项
- 1.试剂
- 目前市场上已经有很成熟的ELISA试剂盒，省去了繁琐的试剂配制过程、大大简化了实验步骤、节省实验者宝贵的时间。
- 提供ELISA试剂盒的厂家有很多，比如Merck Millipore、Peprotech、CST、BD等公司。其中，Peprotech推出的MiNi ELISA KIT，大约可分析200 个ELISA 板（如目录号：900-M98 ），比较适合分析量较小的用户。除了蛋白、细胞因子等ELISA检测试剂盒，针对小鼠、人等物种，Merck Millipore有多种细胞因子检测panel。例如（目录号：MPXMCYTO-70K），可同时检测32种细胞因子，并且用户可根据需要，从中挑选、组合自己需要的细胞因子。
- 2.器材
| 试剂 | 配制方法 |
| 包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液) | NaCO3 1.59克、NaHCO3 2.93克 ，加蒸馏水至1000ml。 |
| 洗涤缓冲液(PH7.4 PBS) | 0.15M KH2PO4 0.2克，Na2HPO4•12H2O 2.9克，NaCl 8.0克，KCl 0.2克，Tween-20 0.05％ 0.5ml ，加蒸馏水至1000ml。 |
| 稀释液 | 牛血清白蛋白(BSA) 0.1克，加洗涤缓冲液至100ml；或以羊血清、兔血清等 血清与洗涤液配成5～10％使用。 |
| 终止液(2M H2SO4） | 蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。 |
| 底物缓冲液(PH5.0磷酸柠檬酸) | 0.2M Na2HPO4(28.4克／L) 25.7ml ， 0.1M 柠檬酸(19.2克／L) 24.3ml，加蒸馏水50ml。 |
| TMB(四甲基联苯胺)显色液 | TMB(10mg／5ml无水乙醇) 0.5ml，底物缓冲液(PH5.5) 10ml，0.75％H2O2 32μl。 |
| ABTS显色液 | ABTS 0.5mg，底物缓冲液(PH5.5) 1ml，3％H2O2 2μl。 |
| 抗原、抗体和酶标记抗体 | |
| 正常血清和阳性对照血清 |
| 聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40孔或96孔 | ELISA检测仪 |
| 50μl及100μl加样器 | 37℃孵育箱 |
| 洗涤瓶 |
- 1.应分别以阳性对照与阴性对照控制实验条件，待检样品应分两份，以保证实验结果的准确性。如果本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。
- 2.各项实验条件的选择很重要，包括:
- (1)固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。
- (2)包被抗体(或抗原)的选择：将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，一般要求PH在9.0～9.6。吸附温度、时间及蛋白量也有一定影响,多采用4℃ 18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg／ml等)进行包被后，在其它实验条件相同的情况下，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg／ml。
- 用于ELISA检测的抗体，纯度一定要好。Abcam、Merck Millipore、BD、Peprotech、CST等公司都有高质量的、专门用于ELISA检测的抗体。其中，Abcam公司的抗体较全、Peprotech、CST公司的抗体较专。
- (3)酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定，然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。
- (4)酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的要求是安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用，应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。
- 其中，TMB用在HRP系统中，对应的检测波长是450nm。加入HRP结合的二抗孵育后，再加入TMB进行显色。Merck Millipore公司（目录号：613544-100ML、ES022-500ML）和CST公司都有不同规格的TMB（目录号：7004S、7004L）。
- ABTS也是HRP的底物之一，对应的检测波长是405nm。ABTS比TMB敏感，显色慢。但是重复实验时比较容易控制显色时间，结果较一致。Merck Millipore公司同样也有两种规格的ABTS（目录号：ES004-100ML、ES004-500ML）。
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