RNAscope-原位杂交新玩法
RNAscope-原位杂交新玩法
RNAscope 是基于 ACD(AdvancedCell Diagnostics Inc., Hayward, CA) 的独特探针设计和信号放大方法的一项新的复合核酸原位杂交技术。RNAscope 方法可替代传统的 ISH/FISH RNA 原位检测的方法，同时单分子检测灵敏度提供了原位对单个细胞基因表达的描绘机会，释放RNA 生物标记的全部潜能。
迄今为止，这个方法是唯一具有原位检测人类转录组中大多数基因敏感性的平台，以及在单细胞水平上同时定量多个RNA转录。为了大幅提高RNA ISH 的信噪比，RNAscope采用类似于荧光共振能量转移 (FRET) 的探针设计策略，两个独立的探针(双 Z 探针)必须串联杂交到目标序列才能引起信号放大发生。因为极不可能出现两个独立探针杂交的非特异性目标恰好相邻确保了只选择性放大特定目标的信号。
单细胞水平上定量 RNA 原位杂交概况
A.使用RNAscope Multiplex Fluorescent Kit 将 HER2 mRNA可视化并通过计数单个 Hela 细胞信号点量化。使用 DAPI 复染细胞核 ( 蓝色 ) 和针对 18srRNA 的探针用作RNA 检测内参。
B.使用“grind-and-bind”方法 (QuantiGene2)量化一同培养的 Hela 细胞的 HER2 mRNA，以估计单个细胞HER2 mRNA 的绝对拷贝数。这两个值吻合，说明 ® RNAscope 具有量化能力。
RNAscope 测定过程可在一天之内完成
准备好样品后, 加入与感兴趣的目标 RNA 互补的探针进行杂交。随后特异性信号放大双 Z 探测系统 , 立即检测并通过标准明场显微镜或多光谱荧光成像系统量化。
针对为每种目标RNA，设计了一个含大约20对双Z目标探针的探针库（pool）用于特异性杂交目标分子，然后通过一连串与前置放大分子、信号放大分子和包含荧光分子或酶显色分子的标记探针的杂交来实现信号放大。
当前RNAscope 2.0对双Z探针的设计方法，需要 1kb的特异序列。它可以应用于只有300碱基的目标序列，但是这样的序列长度无法检测小编码或非编码RNA，如snRNAs、microRNAs、siRNAs、snRNAs、exRNAs、piRNAs--小至 18个碱基。200碱基及以上的长非编码RNA(lncRNAs)是合适RNAscope技术的目标，这是迄今为止最敏感的可对该类基因进行原位检测的方法。
这一突破性的方法带来了众多优势其中包括提高灵敏度、特异性、单分子可视化和量化--还可以应用于部分降解的 RNA 样本(常见于FFPE组织切片)。此方法还支持多通道同时检测多个RNA标记物，在此之前这中检测是极难实现，这主要是由于传统原位杂交很难对多个目标序列找到一个可兼容的探针检测优化条件。
RNAscope可用于同时观测基因组中任意4种或4种以上RNA。此外，多个RNA可以使用混合探针检测方法，如研究人类乳头状瘤病毒 (HPV) 时，有 18 株被认为是高危的，可通过混合探针对其同一进行筛选。生物标记物验证和常规病理诊断可能非常耗时，并且需要数以百计的样本分析。实验室为此需要进行高通量的 RNA 分析，ACD 开发的RNAscope 可使用全自动化的染色设备。这些全自动解决方案可用徕卡生物系统的 BOND RX (Leica Biosystems Nussloch GmbH) 和 Ventana 公司的 DISCOVERY ULTRA 及 DISCOVERY XT 系统 (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson AZ)。此外，在短短两周内，可以开发任何公开或专利的目标序列的新探针，为快速开发生物标记物提供可靠的检测手段。
与传统的原位杂交相比RNAscope具有更高度的灵敏度
与传统的非同位素原位杂交相比，在使用RNAscope对石蜡包埋的人类扁桃体组织进行检测，发现 B 淋巴细胞 IgκmRNA的灵敏性大为改善。RNAscope 或某商业化非放射性同位素 RNA ISH (RISH)对κ轻链mRNA染色，以及RNAscope阴性对照(细菌基因dapB)。
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