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流式实验对照全方位解析

发布日期:2015-11-05  浏览次数:1510  

流式实验对照全方位解析

流式检测的主要目的是正确区分阴性和阳性细胞,并准确计算相关细胞的比例或数量,而合理设置对照对于如何划分阴性和阳性细胞至关重要。流式实验对照主要分为以下几类:

一、空白对照

空白对照即不进行标记的细胞。细胞内物质自身也发出荧光,能被FCM灵敏的检测到,这种未染色的细胞自身发出的一些荧光成为自发荧光,如肿瘤细胞、含颗粒较多的细胞或长期培养的细胞等有相对较强的自发荧光。空白对照主要用于确定待测标本的基础荧光域值或检测染色方法是否成功 。
二、阴性对照
阴性对照的作用是调节各荧光探测器合适的放大倍数,将仪器归零,即确定待测样本的基础荧光域值
1、同型对照
同型抗体为没有特异性、与荧光抗体蛋白亚型一致的免疫球蛋白,通常是未进行免疫小鼠血清的纯化IgG1或IgG2。同型对照就是使用同型抗体进行平行实验,反应待测标本对抗体非特异性结合的水平。

例如,使用的荧光抗体为FITC标记、鼠IgG1亚类抗体,那么其同型抗体应该为FITC标记、鼠IgG1亚型同型抗体。


同型对照可以根据染色方法这样设置;
1)对于直接免疫荧光染色标本,建议选择试剂公司提供的与抗体配套的同型抗体最为阴性对照

注意:同型对照要选择与染色抗体相同剂量及浓度,同型对照要与选用的染色抗体厂家一致

BD 流式抗体的同型对照可在BD 官方网站查找,在相应流式抗体介绍页面下方即可看到BD 推荐使用同型对照





2)对于间接免疫荧光染色标本,设置以同型抗体作为一抗再加荧光二抗的平行管作为阴性对照。若当时无同型抗体,则至少需设置只加二抗、不加一抗作为阴性对照
2、封闭抗体对照
由于有些细胞高表达Fc受体(FcR),如DC、B细胞等,能够通过其FcR与特异性荧光抗体结合,造成其基础荧光域值比较高,影响实验结果的精确性。封闭抗体对照常用于检测某些低表达分子、而该细胞高表达Fc受体的实验。封闭抗体一般为未标记的羊IgG、鼠IgG。封闭抗体对照即用封闭抗体预先与待测细胞共孵育,以阻断待测样本对特异性荧光抗体的非特异性吸附作用,降低待测标本的基础荧光域值。
3、阴性细胞对照
阴性细胞对照即用已知不表达某种抗原的细胞(阴性细胞)进行平行实验,通常用于确定抗体的特异性
4、正常血清或 IgG对照
正常血清对照多用于间接免疫荧光标记技术中,在间接荧光标记过程中,第二抗体多用荧光标记多克隆抗体(如荧光标记的羊抗鼠IgG、大鼠抗小鼠IgG等)。对于某些检测的样本,这些二抗与样本非特异性结合比较高,可能造成其基础荧光域值比较高,影响结果的精确性和灵敏度。为排除这部分干扰,可选用二抗来源动物的正常血清或IgG封闭非特异性结合,降低其基础荧光域值。
操作步骤:先加一抗,再加正常血清或IgG,最后加荧光标记的二抗
三、阳性对照
阳性对照即用已知表达某种抗原的细胞(阳性细胞)进行平行实验,通常用于检测抗体是否有问题或确定实验方法的稳定性、准确性。

如果阳性对照呈阴性或阳性减弱,提示抗体的滴度、特异性可能有问题,也可能是实验方法的问题,如试剂、操作不当等。
四、补偿对照
由于荧光光谱的重叠,对于多色分析样本必须设置补偿对照。补偿对照主要用于多色分析时荧光光谱重叠的补偿调节。补偿对照是将用于多色标记的各种荧光抗体分别与样本反应,一一进行单色标记,以测定荧光信号的重叠并作适当调节 。


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