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CBA流式液相多重定量技术操作全解

发布日期:2015-10-19  浏览次数:2586  

CBA流式液相多重定量技术操作全解


CBA实验流程


流式细胞仪Setup Bead操作流程



流式数据分析
实验前准备


1、准备仪器、耗材
A.12X75mm的BD Falcon流式上样管(Cat#352008)

B.CBA分析软件:FCAP分析软件或CBA Kit Analysis Software分析软件

C.流式细胞仪:配有488nm激光器、可以检测和区分576nm和670nm发射光的流式细胞仪,如BD FACSCalibur、BD FACSArray、BD LSR、BD LSRII、BD FACSAria和Coulter XL等流式细胞仪

D.流式细胞仪质控微球:在装有BD Cell Quest或BD Cell Quest Pro软件的流式细胞仪上,无APC通道的质控微球是CaliBRITE3 Beads (Cat#340486),有APC通道的质控微球是CaliBRITE3 Beads(Cat#340486)和BD CaliBRITE APC Beads(Cat#340487);在装有BD FACS Diva软件的流式细胞仪运行CBA时,质控微球是Rainbow Beads(3.0~3.4um) 等;

在BD FACSarray流式细胞仪运行CBA时,质控微球是Daily QC Particles for FACS array等。

E.低速离心机和Votex

2、实验前清洗流式细胞仪(必须)

以 BD FACSCalibur为例
1)打开 BD FACS Calibur流式细胞仪
2)断开鞘液筒连接
3)旁路鞘液过滤器:鞘液过滤器上端的管路从 SALINE FILTER端口断开,将鞘液管路(白色)取下,连接到 SALINE FILTER端口上
4)鞘液桶中装1:10稀释漂白剂1-2 L
5)仪器处于RUN状态,流速为HI,Falcon样本管中加入1:10稀释漂白剂3mL,加在上样针位置,清洗20-30分钟
6)移去装有1:10稀释漂白剂的Falcon样本管
7)使用加有蒸馏水的鞘液桶和Falcon样本管,同样方法清洗管路(重复第3-5步)
8)将装有鞘液的原鞘液筒恢复原位,连接好鞘液过滤器,上样针位置放盛有 1mL蒸馏水的样本管
9)仪器选择 Stand by模式

3、实验前流式细胞仪质控

A.装有BD Cell Quest或BD Cell Quest Pro软件的流式细胞仪运行CBA时质控(必须获取质控条件)详情请参考《BD FACS Calibur中文培训手册》

1)取出CaliBRITE3 Beads(Cat#340486)。如果有APC通道的流式细胞仪,除了CaliBRITE3 Beads,还需要CaliBRITE APC Beads(Cat#340487)


2)取出两根BD Falcon流式上样管,分别标记上I、II,加1ml鞘液到管I,加3ml鞘液到管II。将瓶口垂直向下挤1滴Unlabeled Beads到管I,混匀。给II管依次加入Unlabeled-、FITC-、PE-、PerCP-Beads各1滴混匀。如果有APC通道,则管I同时加入Unlabeled Beads和APC-labeled
Beads各  1滴,管  11加入所有  Beads各  1滴,最好最后加容易粹灭的  PerCP。混匀,避光放置,准备上机。

3)在流式细胞仪上打开FACSComp软件,出现SignIn视窗,单击Accept,进入SetUp视窗。

4)在左边Assay Selection下点击LYSE/NOWASH模式。在中间CaliBRITE Beads Lot ID中根据CaliBRITE3 Beads试剂盒中每种Beads所对应的编码输入Lot ID,若有APC通道,除了3Beads的LotID,还需要根据CaliBRITE APC Beads试剂盒输入对应的Lot ID。在最上面的Cytometer栏目下打开Preference出现一视窗,在视窗的左端拉到最下面一个图标(CBA图标),双击,出现一个视窗,勾上Create CBA模式,按确定。在SetUp视窗下的右下角单击RUN,出现PMT视窗。


5)管I混匀,上机,按功能键RUN,流速设成HI,点击Start。FACSComp先获取5000个Beads,在单个Beads群的位置设门,开始自动调节PMT。如果有APC通道,FACSComp将自动检测到APC通道并调节其电压。FACSComp根据Target Value自动调节PMT到预期值。如果流速小于400个beads/秒或者PMT自动调节的时间大于75秒,FACSComp将变成手动调节,这时单击Manual键,出现Target Value窗口,手动调节PMT,使SSC的值在TargetValue±5范围内,使荧光通道的值在TargetValue±2范围内。

6)管II混匀,上机,单击start,FACSComp开始自动调节补偿。如果如果流速小于400个beads/秒或者补偿自动调节的时间大于75秒或补偿的值超过50%时,FACSComp会进入手动调节,单击Manual键,手动调节补偿使各补偿值在TargetValue±2范围内。

7)补偿完后自动进入灵敏度调试,单击Start,开始调节灵敏度,调节完后,软件计算出结果,并将所有结果在BD FLIES/INSTRUMENT SETTING里面以CalibFile.LNW形式自动保存(会取代以前的CalibFile LNW文件),同时给出一份Summary Report。点击Quit,退出FACSComp。
如果质控不能通过,则必须再次清洗仪器后质控。

B.装有BD FACS Diva软件的流式细胞仪运行CBA时质控
详情请参考《BD FACS Aria用户指南》

1)启动仪器,选择

“Edit>UserPreference”命令,在“General”页面中,取消所有选项。在“Gates”页面里,将间隔门和象限门都设为“No Color7(无色)”。


2)检查仪器配置:选择

“Instrument>Instrument Configuration”命令。出现“InstrumentConfiguration”对话框。如果当前的仪器配置是“FACS Aria Class”,则进入下一步。如果不是“FACS Aria Class”,在仪器配置列表中选择“FACS Aria Class”,单击“Set Configuration”键,单击“OK”。


3)单击工具栏上的相应工具图标显示“Browser”,“Instrument”,“Inspector”,“Worksheet”和“AcquisitionControl”窗口。选择位于浏览器中的数据库图标,然后单击“Folder”新建一个“Experiment”文件夹,命名,如Jena。选定Jena文件夹,然后在Jena下再新建一个子文件夹,命名为“QC”。


4)打开浏览器中的“群体模板”文件夹,右键单击“QCTemplate”,然后选择”Copy”命令,复制“QC Template”,粘贴至Jena\QC文件下,双击打开粘贴好的“QC”实验。使用当天日期+QC”命名新“QC”实验;使用当天日期命名其内的“Specimen”。

5)使用前摇匀RainbowBeads,取一根12×75mm样品管中,加1ml的鞘液和2-3滴Rainbow Beads,混匀,避光准备上机。双击“BlueTemplate”(工作图中有一个浅绿色页有个图形,用于观察来自488nm波长激光参数的信号)。将“获取指示”移至“BlueTube”旁。蓝色激光信号最优化:样品管装入载样端口,然后单击“Acquisition Control”里的“Load”,样本进样仓,获取程序自动启动。将流速设置为1.0。调节FSC和SSCPMT,使FSC/SSC散点图上P1门内的质控微球数值达到100×103左右。选择“BlueTube”。单击“Inspector”窗口内的“InstrumentSetting”,然后单击“Parameter”。

6)调节蓝色激光的面积因子:调节FITC光电倍增管电压值,使得FITC-H的信号强度达到100×103左右。检查FITC-A和FITC-H的信号强度(见图),如果这两种信号强度是相等的,则进入下一步。如果二者不相等,那么单击在”Instrument”窗口中的”Laser”页面调节面积因子,选定当前的数值,然后输入一个新的数值,直到FITC-A和FITC-H的信号强度相等。为每一参数最优化其光电倍增管电压值,使其信号强度达到100×

103左右。



7)确认获取指示位于“BlueTube”,然后单击“Record”。待“BlueTube”记录完毕,该采集管图标就变成绿色。该“BlueTube”目录下出现与之相应的“Instrument Setting”文件。数据记录完成后,单击”Acquisition Control”窗口上的“Unload”键,取下样品管。将每一荧光参数信号强度的平均值和变异系数记录到质量控制记录表上。


8)如需要,轻微调节最优化红色激光的激光延迟时间设置。使用“RedTemplate”和参数,重复蓝色激光信号调节步骤,最优化红色激光。


9)红色激光延迟时间设置:单击“Laser”页面,将“WindowExtention”调至“0”,可在最窄的时间窗内捕捉到脉冲变化,以“0.1”的数值间隔逐渐调节红色激光延迟时间数值,使细胞群体的平均荧光信号强度达到最高值(典型设置模式如图)。最优化每一荧光参数光电倍增管电压值使其直方图上强度达到100×103左右。将每一荧光参数信号强度的平均值和变异系数记录到质量控制记录表上。


10)紫色激光信号最优调节:重复“最优化红色激光信号”步骤,并使用紫色激光的模板和参数。


11)再次进行质量控制实验时,重复步骤1-2。打开“QC实验”,右键单击首个“Specimen”,选择“DuplicatewithoutData”命令,三个“QCTube”文件同时出现在这一新的“Specimen”目录下,使用当天日期重命名,双击“BlueTemplate”,显示图形,重复步骤5-10。

CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit操作指南(BD Cat.550749)
上机前准备
1、准备样本
CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit的标准品的定量范围是20-5000pg/ml,待测样本为血浆、血清、培养上清、泪液、体液、鼻腔冲洗液等。
1)如果样本是超低温保存,则取出样本,置冰上解冻。
2)如果样本中待测样本浓度超出定量范围,则用Assay Diluent以1:2或1:10等比稀释,稀释后充分混匀。
3)确定待测样本的数目

2、制备标准品(制作标准曲线)
1)重构标准品:取出1根流式上样管,标记为1:1,倒入1管Human Th1/Th2 Cytokine Standard至1:1管中(标准球易粘在瓶盖上,注意倒干净)。加入2ml Assay Diluent,轻轻摇晃几秒种,防止产生气泡(用Tip很容易产生气泡),放置室温15分钟,使标准品完全溶解。
2)等比稀释标准品:取出9根流式上样管,分别标记等比稀释的倍数1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256和0,每管各加300μl Assay缓冲液。从1:1管取300μl完全溶解的标准品到1:2管,吹打混匀,换Tip头,依此类推,直到1:256管为止,如下图所示。每次加样前必须充分混匀和换Tip头。稀释后标准品管(从1:1到0)的浓度(pg/ml)值依次是5000、2500、1250、625、312.5、156、80、40、20、0。稀释好的标准品可4C保存12小时。


3、制备捕获微球(80Tests,微球易沉积,充分混匀是关键)
A.待测样本是细胞培养上清
1)确定上机样本数目:待测样本是N个,标准10个,总共上机样本是(N+10)个,保证每个样本结合每种微球各10μl,所以,每种捕获微球需要的总量是10(N+10)μl。比如,待测样本是6个,总共上机样本是16个,每种混合微球的总量是160μl。


2)加入捕获微球(A1、A2、A3、A4、A5、A6)之前,A1到A6需要蜗旋充分混匀(关键)。


3)取一根流式上样管,标记为Beads,从A1到A6,各取10(N+10)μl。蜗旋充分混匀。


B.待测样本是血清和血浆样本

1)重复细胞培养上清的步骤1-3


2)混合好的微球200g离心5分钟,肉眼观察可见微球沉积,如无沉积,再次离心。用Tips吸去上清。


3)加60(N+10)μl血清Enhancement缓冲液,蜗旋充分混匀,室温避光孵育30分钟。


4、制备上机样本(如下图)
1)取出(N+10)根Falcon流式上样管,分别标记N个待测样本的名字和10个标准品的比例。


2)加入制备好的混合微球:混匀混合微球,每管分别各加50μl捕获微球混合物。


3)加入检测抗体:各管分别加入50μl PE标记的Detection抗体(B)(80Tests)。


4)给10个标准品管各加入50μl对应的稀释好的标准品,给N个待测样本管各加50μl待测样本。


5)蜗旋充分混匀,在室温避光孵育3小时(0管无需孵育)。进入步骤四中的CBA上机条件设置。


6)每管各加1mlwashbuffer,200g离心5分钟,如无沉积,再次离心,小心用TIP吸去上清,最后留大约150μl。如有必要,可以重复该步骤。


7)分别给每个试管加300μlwashbuffer(F),充分混匀,准备上机。样本必须当天分析,否则很容易增加背景和减弱荧光,标准品上机样本。


CBA流式上机条件设置和样本获取


注意:所有上机过程中,获取微球初始需平衡6-7秒再看结果,调节参数后需在Acquire Control窗口反复使用Pause和Restart,以重置得到最新数值。获取上机样本时,注意随时观察平行微球带的变化,注意第一个门是否圈住微球群。
3色Calibur流式细胞仪

A、3色Calibur流式细胞仪CBA上机条件设置(Set up试剂:10Tests)


1)取出3根Falcon流式上机试管,分别标记A、B、C。蜗旋混匀Cytometer Setup Beads微球,A、B、C各管加50μl。


2)在B管加50μlFITC Positive Control抗体,C管加50μl PE Positive抗体。A、B、C管置

室温避光保存30分钟。
3)加450μl Wash Buffer到A管,加400μl到B、C管,每管总共500μl。


4)安装CBA Kit Analysis Software,打开BD CBA Instrument Setup Template。下拉Acquire菜单中选择Connect to Cytometer,出现Acquisition Control对话框,选择Setup。下拉cytometer菜单中打开Detectors/Amps(电压)、Threshold(阈值)、Compensation(补偿)和Status(状态)4个窗口。


5)下拉cytometer菜单,单击Instrument Setting,出现Instrument Setting对话框,单击Open,选择CBA质控3色FACSComp生成的CalibFile.LNW文件(在FACS tation/BD File/Instrument Setting路径下),在Instrument Setting对话框同时单击Set和Done。


6)在电压窗口中调节SSC和FSC电压Mode成LOG。在阈值窗口中点击FSC,调节其域值到650。


7)上试管A,按流式仪上的LOW,在Acquisition Control对话框点击Aquire。如未见聚集的微球群,则在电压窗口中调节SSC电压值,使其在现已的基础上再减去100。见Figure3a,移动门R1圈住微球群,观察到Figure3b出现明暗2群微球带。若未观察到,则需要继续移动R1门。若R1门下见杂质多,则在阈值窗口中同时选择FSC和SSC,调高SSC域值至杂质减少。按流式仪上的Medium。见Figure3b,在电压窗口调节FL3电压值,使R2门内微球群的在FL3上均值大约等于5000(不要移动R2门)。若需要,移动R3圈住FL3上微球。调节FL1电压使FL1的均值在2-2.5之间。见Figure3c,调节FL2电压值使FL2均值在2-2.5之间。


8)上试管B,确认R1圈住微球群。见Figure3c,移动R5圈住亮微球群(勿移动R4),调节FL2-%FL1补偿,使R4和R5在FL2上均值相等。若在R5未见微球群,则可能是补偿过度,调小FL2-%FL1值。


9)上试管C,确认R1圈住微球群。见Figure3d,移动R7圈住亮微球落(勿移动R6),调节FL1-%RL2补偿,使R6和R7在FL1上均值相等。见Figure3e,移动R9圈住亮微球落在里面,调节FL3-%FL2,使R8和R9在均值相等。如需要,调节FL2-%FL3为0.1。


10)下拉Cytometer菜单,单击Instrument Setting,出现对Instrument Setting话框,单击Save,并以“日期+CBA Setup”命名保存CBA Setup条件。

11)上0管,确认R1圈住微球群,观察Figure3b、3c中,出现6条平行微球带,如微球带不平行,则重复CBA上机调节设置直至平行为止。退出CBA Setup模板。



B.3色BD FACS Calibur流式细胞仪CBA上机获取样本


1)打开BD CBA Mouse Isotype Acquire Tempalte,下拉Acquire菜单中单击Connectto Cytometer。在Acquisition Control窗口中,选择Setup。下拉cytometer菜单,单击Instrument Setting,在对话框中单击Open,选择A步骤中保存的CBA Setup条件,同时单击set和done。


2)下拉acquire菜单,单击Acquisition&Storage,出现Acquisition&Storage窗口。在Collection Criteria中,将10000改称1800(保证每种微球收集大约300个),All改成R1。在Storage Gate中选择默认设置:All.。Resolution值调节到1024。单击OK。


3)下拉Acquire菜单中打开Parmeter description窗口,点击Folder,选择流式上机结果保存路径,在此路径下Create一个新文件夹,以“日期+CBA”命名,再Create2个子文件夹,分别命名为Sample和Standard,选择Standard文件夹,单击OK。单击FILE,出现文件名编辑窗口,在customprefix中命名文件(文件名前两位必须是字母)。


4)样本上机之前必须蜗旋3-5秒,混匀。上0管,按流式仪上LOW,在acquisition control对话框单击Acauire,见Figure4,移动R1圈住微球群。按流式仪上HIGH,取消acquisition control对话框中Setup,单击Acquire采集至结束,按照浓度从低到高依次上1:256管至1:1管采集标准品样本。如果样本浓度增高,水平微球微带在FL2上向均值大的方向移动。


5)参照第3步打开Parmeter description对话框,单击Folder,选择Sample文件夹,依次上待测样本管。




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