分离淋巴细胞（或裂解红细胞）--细胞刺激---阻断Fc受体--细胞表面染色--固定--破膜--胞内染色1.获取实验的组织（脾脏、淋巴结、胸腺、骨髓），然后分离淋巴细胞，制备单细胞溶液，buffer可用Stain Buffer(FBS)
2.如果是体外刺激培养的细胞，可直接用Stain Buffer(FBS)重悬刺激的细胞
3.加Stain Buffer(FBS)到离心管至10ml，350g离心5min。
如果做的组织是脾脏，需要裂解红细胞。首先把10X的红细胞裂解液Lysing Buffer用蒸馏水配制成1X工作液。后续操作可参考Lysing Buffer说明书。5.细胞计数后，加Stain Buffer(FBS)调整细胞数浓度在5-10x106cells/ml，以每管100ul的细胞悬液加到流式管中，这样细胞数浓度接近于5-10x105cells/ml。6.取出6孔板，做好标记（未刺激孔、刺激孔），每孔加入1ml淋巴细胞悬液,再分别加入
1ml RPMI1640（10%FBS），混匀，避免产生气泡。
7.刺激孔分别加入刺激剂和阻断剂，用枪吹打混匀,尽量避免产生气泡。9.刺激5小时后，收细胞，同时用1ml RPMI1640冲洗细胞培养板，一起收集到离心管中，350g离心5min，弃上清。10.分别加入2ml Stain Buffer(FBS)中，350g离心5min。
11.弃上清，分别重悬细胞到1ml Stain Buffer(FBS)/管。
Mouse BD FcBlock™ 阻断非特异的受体。13.加入适量的CD3、4、8等表面标记抗体到已准备好的细胞悬液里。冰上or室温,避光孵育15-20min.14.加入至少2ml的Stain Buffer(FBS)洗2次。350g离心5min，弃上清。
15.加入0.5ml的Stain Buffer(FBS)重悬细胞。
16.可根据选用的固定剂、破膜剂按照试剂规范protocal进行操作17.加100ul Perm/Wash™buffer重悬固定破膜后的细胞，加入适量的荧光标记抗体IL-4、IFN-γ、IL-17A及同型对照，冰上or室温避光20min18.用1ml Perm/Wash™buffer把细胞洗两遍。350g离心5min，弃上清。
19.用0.5ml Stain Buffer(FBS)重悬固定染色后的细胞，上机检测分析。
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