关闭
扫一扫 更精彩
关闭
敏泰元生物 — 细胞与免疫学专业服务平台

Technical Information

| 技术资料
首页 // 技术资料 // 流式检测小鼠Th1/2/17实验方案

流式检测小鼠Th1/2/17实验方案

发布日期:2015-09-18  浏览次数:1819  

流式检测小鼠Th1/2/17实验方案


流式细胞术检测小鼠 TH1/2/17实验全过程


实验流程
分离淋巴细胞(或裂解红细胞)--细胞刺激---阻断Fc受体--细胞表面染色--固定--破膜--胞内染色
分离淋巴细胞

1.获取实验的组织(脾脏、淋巴结、胸腺、骨髓),然后分离淋巴细胞,制备单细胞溶液,buffer可用Stain Buffer(FBS)

2.如果是体外刺激培养的细胞,可直接用Stain Buffer(FBS)重悬刺激的细胞

3.加Stain Buffer(FBS)到离心管至10ml,350g离心5min。

4.倾倒上清液,用完全培养基重悬细胞,细胞计数。
裂解红细胞

如果做的组织是脾脏,需要裂解红细胞。首先把10X的红细胞裂解液Lysing Buffer用蒸馏水配制成1X工作液。后续操作可参考Lysing Buffer说明书。

5.细胞计数后,加Stain Buffer(FBS)调整细胞数浓度在5-10x106cells/ml,以每管100ul的细胞悬液加到流式管中,这样细胞数浓度接近于5-10x105cells/ml。
细胞刺激

6.取出6孔板,做好标记(未刺激孔、刺激孔),每孔加入1ml淋巴细胞悬液,再分别加入
1ml RPMI1640(10%FBS),混匀,避免产生气泡。

7.刺激孔分别加入刺激剂和阻断剂,用枪吹打混匀,尽量避免产生气泡。

8.放入37℃,5%CO2培养箱培养5h。

9.刺激5小时后,收细胞,同时用1ml RPMI1640冲洗细胞培养板,一起收集到离心管中,350g离心5min,弃上清。

10.分别加入2ml Stain Buffer(FBS)中,350g离心5min。

11.弃上清,分别重悬细胞到1ml Stain Buffer(FBS)/管。
阻断FC受体

Mouse BD FcBlock™ 阻断非特异的受体。
细胞表面染色抗体

13.加入适量的CD3、4、8等表面标记抗体到已准备好的细胞悬液里。冰上or室温,避光孵育15-20min.

14.加入至少2ml的Stain Buffer(FBS)洗2次。350g离心5min,弃上清。

15.加入0.5ml的Stain Buffer(FBS)重悬细胞。
固定-破膜

16.可根据选用的固定剂、破膜剂按照试剂规范protocal进行操作
胞内染色

17.加100ul Perm/Wash™buffer重悬固定破膜后的细胞,加入适量的荧光标记抗体IL-4、IFN-γ、IL-17A及同型对照,冰上or室温避光20min

18.用1ml Perm/Wash™buffer把细胞洗两遍。350g离心5min,弃上清。

19.用0.5ml Stain Buffer(FBS)重悬固定染色后的细胞,上机检测分析。
检测小鼠Th1/2/17相关产品



了解更多细胞与免疫学实验技术  欢迎关注敏泰元生物微信


www.mintaibio.com