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ChIP实验原理及步骤

发布日期:2012-12-10  浏览次数:6504  

ChIP实验原理及步骤

  • 一. ChIP的概念
  • 真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。因此,研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。染色质免疫沉淀技术(chromatinimmunoprecipitation assay, ChIP)是研究体内蛋白质与DNA相互作用的一种技术。它利用抗原抗体反应的特异性,可以真实地反映体内蛋白因子与基因组DNA结合的状况。其应用范围已经从研究目的蛋白与已知靶序列间的相互作用,发展到研究目的蛋白与整个基因组的未知序列的相互作用;从研究一个目的蛋白与DNA的相互作用,发展到研究两个蛋白与DNA共同结合的相互作用;从研究启动子区域的组蛋白的修饰,发展到研究结合在DNA序列上的蛋白复合物。
  • 二.ChIP技术的原理
  • ChIP的基本原理是在活细胞状态下把细胞内的蛋白质和DNA交联,超声波将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后用所研究的目的蛋白质特异性抗体免疫沉淀蛋白质-DNA 复合体,从而特异性地富集目的蛋白结合的DNA 片段。染色质免疫共沉淀是理解染色体的一种革命性工具,使研究者了解染色质及其相结合的调控因子之间的时空动态相互作用。
    ChIP原理图
  • 三.ChIP具体实验步骤
  • 细胞固定—染色质断裂—染色质免疫沉淀—交联反应的逆转和DNA的纯化—DNA的鉴定
    1. 1.细胞的甲醛固定
    2. 交联所用的甲醛终浓度约为1%,而交联时间需要预实验来确定。交联时间如果过长,细胞染色质难以用超声波破碎,影响ChIP 结果,而且实验材料也容易在离心过程中丢失。交联时间如果过短,则交联不完全,产生假阴性。甲醛的交联反应可被甘氨酸终止。通常的交联条件为室温10 min。
    3. 2.染色质断裂
    4. 通常采用超声波断裂染色质。超声波使用机械力把染色质断裂成200-1000bp左右的片段,容易引起升温或产生泡沫,这都会引起蛋白质变性,进而影响ChIP 的效率。所以在超声波断裂染色质时,要在冰上进行,且要设计时断时续的超声程序,保证低温。
    5. Micrococcal Nuclease也可以将染色质切成一到几个核小体,比超声波处理的结果更精致,更均一(图1)。酶处理染色质适用于新鲜的细胞或组织样品和冰冻样品。在研究组蛋白时,经常采用没经过甲醛固定的Native ChIP(N-ChIP)的研究方法。因为N-ChIP没经过甲醛固定,超声波处理会打断组蛋白和DNA的结合,所以只能选择酶处理染色质的方法。对于甲醛固定的样品,一般选择超声波处理方法。
    6. 图1.染色质断裂方法比较
    7. 3.染色质免疫沉淀
    8. 抗体的量要进行优化,防止非特异的结合。用Protein-A/G Sepharose 回收免疫沉淀复合体,经过洗涤除去非特异结合的染色质。
    9. 4.65℃解交联蛋白质和DNA 复合物,消化蛋白质,纯化富集的DNA。
    10. 在免疫沉淀复合体中加入不含DNase 的RNase 和蛋白酶K,65℃保温6h 以上,使交联逆转。交联逆转后纯化回收DNA。
    11. 5.DNA鉴定
    12. 最常用的DNA的鉴定方法是半定量PCR和Real-time PCR。由于启动子区域的序列具有多样性的特点,所以不同的细胞系或不同的动物品系的同一基因的启动子序列有可能不同。而且启动子区域多富含CG的序列,其PCR条件可能需要相应调整。有条件可设计不止一对引物来反复验证ChIP实验的结果。
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