常见问题分类及解答

常见问题分类

1. 细胞密度太高或者汇合太快

2. 细胞汇合太慢

3. 细胞未能迁移至基底室

4. 细胞还未接受刺激就已经迁移至基底室

5. 细胞单层受到破坏

6. 显微镜下观察不到细胞

7. 上室出现漏液或充满培养基，膜上有洞

8. 细胞形态不正常

9. 实验所需培养基或者裂解液不充足

10. 培养基溢出

11. 染色时膜被溶解

12. 染色时密封失败或者泄漏

13. 培养基在小室之间流串

14. 细胞贴壁不好

15. 细胞生长不好

16. 信号超过检测系统的敏感范围

17. 没有信号或者信号比预期的弱

18. 未预期的实验结果

19. 迁移实验中，对照组和测试组之间没有差别

20. 生物污染

详细解答列表

1. 细胞过度汇合或者汇合速率过快

* 细胞培养时间过长。重新开始实验，缩短培养时间或者降低细胞起始铺板密度。

* 细胞起始密度过高。重新开始实验，降低细胞起始铺板密度。

* 细胞传代次数太多。随着衰老和代数增加，细胞形态会发生一些变化。有可能这次实验的细胞比之前的代数靠前或者靠后，造成实验结果不稳定。复苏代数靠前的细胞重新开始实验。

2. 细胞汇合太慢

* 细胞培养时间不够。继续培养细胞至更长时间。

* 细胞起始密度太低。继续培养细胞或者以更高的细胞密度重新开始实验。

* 细胞传代次数太多。随着衰老和代数增加，细胞形态会发生一些变化。复苏代数靠前的细胞重新开始实验。

* 培养基不适合这株细胞。确保使用正确的培养基，并且加入所有的添加物。以新鲜培养基重新开始实验。

3. 细胞未能迁移至基底室

* 选择的膜孔径偏小。确保选择合适孔径的膜，可以尝试更大孔径的膜。

* ECM铺得太多。过多的ECM可能会堵住孔，尝试使用少量ECM或者其它种类的ECM。

* 对细胞的刺激没有促迁移作用。确保采用适合该细胞迁移的刺激以及正确的浓度。设置阴性和阳性对照组。

* 细胞传代次数太多。随着衰老和代数增加，细胞形态会发生一些变化。复苏代数靠前的细胞重新开始实验。

* 实验所用的细胞系不正确。确保使用正确的细胞系以及正确的刺激浓度。设置阴性和阳性对照组。

4. 细胞还未接受刺激就已经迁移至基底室

* 膜的孔径太大。重新开始实验，使用孔径稍小的膜。

* 细胞种错了位置。细胞应该种在上室。

* 膜上可能有洞。补加或者移走培养基时需要小心，避免戳破膜。很多 Millicell装置都有顶端辅助区域，以方便移液枪操作。

5. 细胞单层受到破坏

* 更换培养基时不小心碰触细胞。补加或者移走培养基时需要小心，特别是在上室操作时，避免戳破膜。许多 Millicell装置都有顶端辅助区域，以方便移液枪操作。

* 加入细胞和培养基的顺序有误。不要在刚种下的细胞上加培养基。采取先按照某一浓度混匀细胞再接种或者先加培养基再种细胞的方式。

* 培养基高度内外不平。上室里面的培养基和基底室的应该保持相同高度。查看说明书，参照每部分区域的推荐体积。

6. 显微镜下观察不到细胞

* 膜的类型不适合显微镜观察。不是所有膜的材质或孔径大小都适合于显微镜观察。查看说明书以找到推荐合适的膜。

7. 上室出现漏液或充满培养基

* 膜上可能有洞。补加或者移走培养基时需要小心，特别是在上室操作时，避免戳破膜。许多 Millicell装置都有顶端辅助区域，以方便使用移液枪更换培养基。

8. 细胞形态不正常

* 细胞可能需要不同类型的膜（例如， PET膜替代聚碳酸酯膜）。考虑所使用的膜是否最适合该细胞。

9. 实验所需培养基或者裂解液不充足

* 实验所选装置的孔太小。选择孔数少一些的板（例如从96孔板转移至24或者6孔板）或者将细胞从孔中转移出来，另作所需的处理。

10. 培养基溢出

* 上室或者基底室的培养基太多。查看说明书，参照每部分区域的推荐体积。

11. 染色时膜被溶解

* 染色液的溶剂与膜的材质不相容。例如，甲苯溶剂与聚碳酸酯膜不相容。

12. 染色时密封失败或者泄漏

* 染色液的溶剂与膜的材质不相容。例如，甲苯溶剂与聚碳酸酯膜不相容。

13. 培养基在小室之间流串

* 上室培养基的高度与基底室的不平。查看说明书，参照每部分区域的推荐体积。

14. 细胞贴壁不好

* 实验所用的细胞可能需要不同的培养基或者添加物。根据ATCC建议，再次确认细胞所需要的培养基成分和所需添加物。

* 细胞可能需要ECM。种细胞前，铺一层合适的ECM。

* 细胞可能需要另一种ECM。如果细胞贴壁需要ECM，确保使用的ECM是最合适的，而且浓度正确。

* 起始细胞密度不正确。尝试增大或者降低起始细胞密度

* ECM有可能被培养基稀释。在种细胞和加培养基之前，先铺ECM细胞适合在其他类型的膜上贴壁（例如聚碳酸酯膜或者PET膜）。考虑所使用的膜是否最适合该细胞。

* 基底室培养基过多导致培养基流入上室。查看说明书，参照每部分区域的推荐体积。

15. 细胞生长不好

* 培养时间不充分。继续培养。

* 起始细胞密度不正确。提高起始密度，重新开始。

* 细胞培养基或者添加物不正确。根据ATCC建议，再次确认培养基成分和所需添加物。

* 培养基太多或者太少，或者体积不足以覆盖整个表面。查看说明书，参照每部分区域的推荐体积。

* 细胞传代次数过多。复苏代数靠前的细胞，重新开始实验。

* 细胞生长可能需要ECM。种细胞前，铺一层合适的ECM。

16. 信号超过检测系统的敏感范围

* 样品浓度太高以至于不能精确检测。使用小体积；稀释样品；使用更小孔的板（例如从24孔板转移至96孔板）

* 检测波长不正确。再次确认检测试剂的激发光和发射光。

* 背景太高。降低检测抗体的浓度；降低孵育时间；增加漂洗次数。

* 细胞需要其他种类的ECM。如果细胞需要ECM，确保使用的ECM种类和浓度都是最合适的。

17. 没有信号或者信号比预期的弱

* 激发光或者发射光不正确。再次确认检测成分的激发光和发射光。

* 检测试剂的浓度太低。增加检测试剂的浓度。

* 检测试剂的孵育时间不够。延长孵育时间。

* 荧光检测试剂储存或者反应时曝光了。避免荧光试剂曝于光下以防止光解作用。

* 细胞数量不够或者不在合适的实验状态。确保细胞足够，并且状态适合实验。

18. 实验结果与预期不符

* 刺激加错孔了。再次确认添加顺序和刺激的位置。

* 刺激加入基底室而不是上室细胞（反之亦然）。检查对照组是否正常。

* 对照组不充分，干扰实验结果。设置足够的对照组，以便更合理地诠释结果。

* 刺激方法不正确。再次确认使用的刺激方法是正确的，并且适合该细胞。

* 刺激的体积或者浓度不正确。再次确认刺激浓度，如果有必要，做浓度曲线。

* 细胞在更换培养基时被吸走。更换培养基时，采用顶端辅助区域。

* 培养基没有得到有效更换。培养在板上的细胞培养基更换要比在dish或者flask里的更频繁，也要依照细胞密度而定。

19. 迁移实验中，对照组和测试组之间没有差别

* 细胞传代过多。复苏代数靠前的细胞，重新开始实验。

* 移去培养基的顺序有误（基底室和上室）。使用合适的对照，检查添加/替换的顺序是否会影响实验结果。

* 使用的装置有误。确定使用合适的板。检查对照组是否正常。

* 小室膜的上层擦拭不充分。一些实验只需要观察基底面的细胞，但是两面的细胞会被染上色并检测到，所以要擦去上层。

20. 生物污染

* 包装破坏被污染。确保使用前包装完好，在无菌条件下打开密封。

* 非无菌操作。练习正确的无菌细胞培养技术。

* 培养基污染。使用前无菌过滤所有的培养基。使用带有酚红的培养基以通过颜色变化监测早期污染。

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