距估算约有10%的细胞蛋白质会发生磷酸化共价修饰。蛋白质磷酸化修饰是细胞的一种重要的信号调节机制，调节着细胞生长、增殖、泛素 （ubiquitin）介导的蛋白降解等过程。研究蛋白质磷酸化，Western Blotting是一种常用的方法，但与一般的Western Blotting相比，磷酸化特异性的Western Blotting难度要大很多，经常会遇到假阴性结果或背景偏高或缺少合适的磷酸化抗体等问题，这里，我们将和大家分享来自默克密理博提高磷酸化蛋白检测 效果的一些实验设计和实验技巧。

在以前的科研里，没有抗磷酸化抗体，蛋白质和激酶的磷酸化只能通过非常危险的并且费时的放射性实验来检测。现在利用抗磷酸化抗体，则可以通过 Western Blotting或其它免疫学方法轻松地检测到磷酸化信号。常规的检测方法包括：用抗目标蛋白的磷酸化特异性抗体在Western Blotting上检测内源或外源表达的特定蛋白的磷酸化的发生；通用型的抗磷酸化抗体也常用于检测在不同处理的条件下，细胞内总的磷酸化水平的变化情 况，作为许多细胞生物现象的一个重要指标。

有些时候蛋白磷酸化的Western Blotting检测结果不好，可能是由于目标蛋白的表达量太低或目标蛋白磷酸化的水平不高导致。

如果目标蛋白的含量较低，可以利用免疫沉淀（IP）的方法先富集目标蛋白，再检测目标蛋白的磷酸化水平。

目标蛋白磷酸化水平不够高的情况，发生在酪氨酸位点的磷酸化尤为常见。酪氨酸磷酸化是细胞信号转导和酶活性调控的一种主要方式，但在细胞的所有磷酸 化修饰中所占的比例却非常低，大约每100次蛋白质的磷酸化修饰中仅有1次酪氨酸基团的修饰，与丝氨酸和苏氨酸磷酸化水平相比，酪氨酸磷酸化的水平估计要 低2000倍。然而正是由于细胞中酪氨酸磷酸化的水平相当低，才能保证细胞在内外信号的刺激下，作出灵敏的反应，所以研究酪氨酸的磷酸化对于细胞信号调控 的研究具有极为重要的意义，识别发生酪氨酸磷酸化的蛋白质及鉴定这些酪氨酸位点能帮助揭示药物的作用位点。

针 对目标蛋白磷酸化水平不够高的情况，可以先把细胞内总的磷酸化蛋白进行富集，再把富集的组分上样跑胶检测。推荐采用专门针对Western Blotting的ProteoExtract®磷酸化蛋白富集试剂盒。如果是酪氨酸位点的磷酸化，也可以使用酪氨酸磷酸化的通用型抗体4G10偶联的磁 珠或琼脂糖珠子来特异性富集酪氨酸磷酸化蛋白质，把细胞内大量的丝氨酸、苏氨酸磷酸化蛋白质和其它的蛋白质分离开来。
我们都知道如果需要检测某一个目标蛋白的某一特定位点的磷酸化状态，可以选用该蛋白质特定位点的磷酸化特异性抗体。但有很多时候，由于我们研究的是新的磷 酸化位点，或者市场上的磷酸化抗体效果不够好，我们不得不自己制备磷酸化抗体。如果大家已有制备磷酸化抗体的经验，就会知道磷酸化抗体的制备比一般抗体的 制备更加困难，而且浪费大量的宝贵时间。现在国外的科学家发现，结合使用通用型的磷酸化抗体，只要巧妙的设计实验，也可以达到同样的检测目的。

以Yuan的文章为例，他们需要检测BCR-ABL的磷酸化，但他们没有特异性的磷酸化抗体。他们首先使用了抗c-ABL的抗体和蛋白G-琼脂糖珠 子来免疫沉淀富集BCR-ABL蛋白，然后再通过Western-Blotting和4G10通用型磷酸化抗体（pan- phosphotyrosine）来鉴定BCR-ABL蛋白的酪氨酸特异性磷酸化水平。

另外一组以Clemens为首的科学家，则利用抗Dock蛋白抗体先免疫共沉淀了与Dock相互作用的DACK和DSH3PX1蛋白，再用4G10 酪氨酸磷酸化抗体来检测DACK蛋白和DSH3PX1蛋白的酪氨酸磷酸化水平，通过区分这些蛋白的分子量大小，来确认相应的磷酸化条带的蛋白身份。

还有一些实验是用Western Blotting来验证一组磷酸化的多肽或蛋白的存在，这时候也需要使用通用型磷酸化抗体。对于这种实验目的，需要选用的磷酸化抗体具有广泛的识别范围、同时又有很好的磷酸化特异性（例如4G10抗体），才不会导致假阴性结果的产生。

Liu的研究为例，他们就对比使用了通用型的磷酸化抗体4G10和PY20，利用Western Blotting来验证不同抗体通过多肽芯片筛选出的磷酸化多肽结果。他们的实验室是这样设计的，首先利用磷酸化酪氨酸的多肽芯片（phospho- tyrosine peptide array）来筛选与SH2结构域结合的磷酸化多肽序列，然后对这些合成的多肽序列进行Western Blotting验证，利用通用型的抗酪氨酸磷酸化抗体4G10和PY20检测其磷酸化水平。他们发现不同的抗体具有很不一样的识别特异性，如pTyr- Pro 序列能被某些SH2结构域结合，而不被4G10和PY20识别。但就总体而言，通用型的抗酪氨酸磷酸化抗体可以识别绝大多数的SH2结构域结合的磷酸化多 肽，特别是4G10抗体比PY20抗体能识别更多的磷酸化酪氨酸多肽。

与做普通的Western Blotting相比，磷酸化Western Blotting还有一些小技巧：

首先，由于蛋白的磷酸化是可逆的，会被磷酸酶去磷酸化，所以在样品制备和整个免疫检测过程中，需要抑制或避免细胞内源性和外源性的磷酸酶的干扰。

针对细胞内源性的磷酸酶，我们在样品制备时，需要在细胞裂解液中加入足量的并且是新鲜的磷酸酶抑制剂（推荐PhosphoSafe 系列）。
对于外源性的磷酸酶，这主要是由实验过程中的其它试剂带入的，尤其是封闭剂。针对磷酸化检测不能使用粗制蛋白作为封闭剂，以避免粗制蛋白里的磷酸酶的去磷 酸化作用，或其中可能含有的磷酸化蛋白造成的非特异性背景。因此，大家需要尽量使用专门为磷酸化检测设计的封闭剂（例如Bløk-PO）。有实验表明，在 封闭剂中加入磷酸酶抑制剂能提高磷酸化特异性免疫检测的信号(Sharma and Carew, 2002)。Bløk-PO里就含有磷酸酶抑制剂，能保证膜上蛋白磷酸化状态的完整。

除了封闭剂以外，样品中或其它试剂中带的细菌也会分泌外源性的磷酸酶，所以做磷酸化Western Blotting的另一个关键是要尽量使用清洁的新鲜的溶液和新做的SDS聚丙烯酰胺凝胶，并且最好在样品制备完就立刻上样，当天完成SDS-PAGE和 Western Blotting 检测。如果要使用同一张膜进行总蛋白的检测，就需要先做磷酸化的检测再做总蛋白的检测，以尽量避免磷酸化信号的丢失，这点非常重要。

除了磷酸化的Western Blotting以外，目前关于磷酸化的研究还有一些其它的方法，如发现新的磷酸化位点的磷酸化蛋白质组学研究，还有使蛋白质发生磷酸化的激酶活性分析，请关注默克密理博不断推出的磷酸化检测新方法。

参考文献：

1. Clemens JC et.al. Use of double-stranded RNA interference in drosophila celllinesto dissect signal transduction pathways. PNAS (2000)
2. Guha U et.al. Comparisons of tyrosine phosphorylated proteins in cells expressing lung cancer-specific alleles of egfr and kras. PNAS (2008)
3. Lind SB et.al. Immunnoaffinity enrichments followed by mass spectrometric detection for studying global protein tyrosine phosphorylation. JPR (2008)
4. Liu BA et.al. SH2 domains recognize contextual peptide sequence information to determine selectivity. MCP (2010)
5. Nelson EA et.al. Nifuroxazide inhibits survival of multiple myeloma cells by directly inhibiting stat3. Blood (2008)
6. Petersen J & Hagan LM. Polo kinase links the stress pathway to cell cycle control and tip growth in fission yeast. Nature (2005)
7. Yuan H et.al. BCR-ABL gene expression is required for its mutations in a novel KCL-22 cell culture model for acquired resistance of chronic myelogenous leukemia. JBC (2010)

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转载自：默克密理博蛋白研究工具超市