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默克Calbiochem抑制剂的使用技巧

发布日期:2015-04-21  浏览次数:2158  

默克Calbiochem抑制剂的使用技巧

实验中需要加多少抑制剂? 

抑制剂的使用量受多种因素影响,包括抑制对象的可接触性,细胞通透性,孵育时间,细胞种类等等。我们建议通过检索文献确定使用抑制剂的起始浓度。如果有报道的Ki值或IC50值,可以采用其5-10倍的量开始尝试以达到抑制酶活性的最佳效果。如果抑制剂的Ki值或IC50值未知,则需要在更广泛的范围尝试抑制剂的使用浓度,并采用Michaelis-Menten动力学计算Ki值。采用高浓度抑制剂而没有抑制效果,甚至得到相反的结果等情况并不罕见。最好设立溶解抑制剂所采用的溶剂作为对照,以排除溶剂的非特异性影响。

 

EC50ED50KiIC50KdpIC50各指什么?它们有什么区别? 

药理和生化研究中,以下一些术语常常被用来描述药物或抑制剂的功效;有时如果研究者没有弄清原文献作者使用的术语的确切含义,在重复这些实验时会产生困扰。

EC50值:药物达到最大临床功效 (有时是抑制或刺激效果)50%时的浓度。这是一个药用术语。

ED50值:50%的个体表现特定药效时药物的有效剂量(而非浓度)。

IC50:达到 50%抑制效果时抑制剂的浓度。

Ki值: 检测到 50%抑制效果时的抑制剂的浓度(采用Michaelis-Menten动力学计算而获得)

Kd值:二个或更多生物分子组成的复合物分离成组分时的平衡常数 ;例如,抑制剂或底物从酶分离时的pIC50值。

pIC50值:IC 50值的10的负对数。

 

怎么确定做活体实验时需要注射多少抑制剂或者刺激物呢? 

回答这个问题并不容易。需要通过一些经验性的预实验来获得试剂的优化剂量。首要考虑是这种试剂必须具备细胞穿透性。检索报道过的IC50值,ED50值或EC50值也非常必要。以下介绍一个抑制剂用量的常用估算方法:

H-89(一种二氢氯化物)为例。这是一种细胞穿透性蛋白激酶A抑制剂,IC50值为48nM,分子量是519.3240-480nM可以产生足够的蛋白激酶A的抑制效果。活体(in vivo)实验时我们还需要做一些估算。假定一只200g的大鼠含水量为70%,则抑制剂约在140ml中分布;这样240nM = 240nmoles/L=124.63μg/L。抑制剂溶于140ml,即124.63×0.140 = 17.45μg,所以这只200g的大鼠需要注射的剂量为17.45ug。同时,抑制剂在体内的实际分布与注射方式(静脉注射,肌肉注射还是腹腔注射?)药物利用率,半衰期,肝肾清除率,与蛋白的结合,组织特异性分布与富集等等紧密相关。特定组织或器官吸收抑制剂的量也往往比分离的细胞吸收量少。在整个活的动物体上的研究,常常要求抑制剂达到一定的目标浓度的负荷剂量,因此也需要通过持续给药以保持血液中相应的抑制剂浓度。同时,做这类实验必须总是特别小心,以免在动物上用药过量。

 

抑制剂的最适溶剂是什么? 

一般来说,生物学实验中水常常是最佳溶剂。然而一些有机化合物难溶于水或遇水迅速降解,这时就要选用别的溶剂了。如果推荐用 DMSO作为溶剂,应该使用没有吸潮的新开封的DMSO,如果有潮气污染,很容易带来抑制剂降解或难溶的问题。

 

为什么不能直接用我的缓冲液对抑制剂DMSO母液做梯度稀释? 

有时这并不会产生问题。但大多数情况下有机试剂直接加入水相介质时容易发生沉淀而析出。较好的做法是将抑制剂先以DMSO做梯度稀释,再将经过稀释的抑制剂加入缓冲液或细胞培养基。有些抑制剂甚至只有在其工作浓度下才能溶于水相。

 

哪种蛋白激酶抑制剂最适合我的实验? 

如果磷酸化机制尚不明了,很多抑制剂,例如Staurosporine,可以先用来确定是否有蛋白激酶参与。紧接着,一个更特异的PKA抑制剂(例如H-89产品编号3719638-Br-cAMPRpisomer产品编号116816)、PKC抑制剂(例如Bisindolylmaleimide产品编号203290)PKG (例如KT5823产品编号420321370654)来排除多种激酶参与反应的可能性。为了确切阐明调控机制,甚至需要选用同工酶特异性抑制剂,例如PKC就有不少这样的抑制剂可供选择。

 

怎么确定一个caspase抑制剂是可逆的还是不可逆的? 

Caspase抑制剂的C端决定了其是可逆的或不可逆的。一般来说,有醛基(CHO)的caspase抑制剂是可逆的。CMKFMKFAOM等基团反应性更强,会与酶形成共价键,形成不可逆连联接。FMKCMK反应略弱,因此被认为是酶抑制位点更特异的抑制剂。

 

某一特定caspase抑制剂的特异性由哪些因素决定? 

多肽识别序列决定了 特定Caspase抑制剂的特异性。有时多肽的天冬氨酸残基经酯化以增加其细胞穿透性。VAD是通用的caspase抑制剂。早前VAD只是作为caspase-1 (ICE)的特异性抑制剂,现在发现它还能抑制caspase-3caspase-4。在这个序列上再加一个酪氨酸残基(Y)形成YVAD,则是caspase-1的特异性抑制剂。DEVD序列识别caspase-3以及caspases-6-7-8-10

 

FMKcaspase抑制剂有什么优点?它们与CHO型的有什么不同? 

FMKcaspase抑制剂会对酶的硫醇基团进行共价修饰,因此都是不可逆抑制剂。一般来说,在这种抑制剂的氨基末端都有一个苄氧羰基(Z,生物素或乙酰基(Ac)。 这些基团都会增加抑制剂分子的疏水性,从而提高了其细胞穿透性。与带有生物素或Ac基团的抑制剂相比,带有Z基团的抑制剂的细胞穿透性更好。含生物素基团的抑制剂常常用于标识酶-抑制剂位点的检测。CHO型抑制剂的醛基可以与caspase酶的硫醇基间可逆形成一个加合物,因此这类抑制剂是可逆的。通常CHO型抑制剂是亲水的,因此细胞吸收较慢。可逆抑制剂的可逆情况与实际的pH值,金属离子浓度等条件有关。当醛基结合上天冬氨酸(D-CHO), 这个产物会以假酸醛形式动态平衡。这使得这类抑制剂有些许细胞穿透性。

 

选择蛋白酶抑制剂的原则是什么? 

在处理细胞或组织时,要考虑到细胞会向培养基中分泌具有活性的蛋白酶,培养基本身也常常带有活性蛋白酶。因此,在样本制备的早期步骤中加入蛋白酶抑制剂是非常必要的。为了获得稳定的最佳效果,建议使用前新鲜配制抑制剂。长期存放在缓冲液中的抑制剂很可能失效,最好不要使用。不同的细胞或组织类型其含有的蛋白酶情况也有所不同。丝氨酸蛋白酶在各种细胞中广泛存在;细菌含有较多的丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶;动物组织抽提物富含丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶,而植物抽提物含有更多的丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。此外,在制备IMAC(金属螯合亲和纯化,例如His·Tag纯化)材料时要避免使用EDTA。如果不太清楚样本中的蛋白酶种类,最好采用抑制剂混合物或者自行调配专用的抑制剂混合物。


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