免疫组化常见问题及解决方案

 

一、非特异性染色

1.      内源性酶和生物素有残留。对于内源性酶或生物素丰富的组织，如肝脏、肾脏等，才需考虑此原因。

（1）    灭活碱性磷酸酶的常用方法是将左旋咪唑（24mg/ml）加入底物液中，并保持pH值在7.6~8.2。对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶，可用50mmol/L的酒石酸抑制。

（2）    消除内源性生物素的方法是事先滴加亲和素，以饱和内源性生物素，使之不再有剩余的结合位点。具体方法是在ABC法或SP法染色前将切片浸于25ug/ml亲和素溶液中处理15分钟，PBS清洗15分钟后即可染色。徕卡（Leica）提供专门的抗生物素/生物素封闭系统（code：RE7107），可以很好地消除内源性生物素引起的高背景。

2.      封闭剂使用不当。

可以用二抗动物的非免疫血清孵育切片，以封闭吸附位点。有时其它无关蛋白，如牛血清白蛋白也常应用。另外，取材时避开出血、坏死区也极其重要。封闭剂的选择也很重要，不妨试试Merck Millipore IHC专用的封闭剂（code：20773），搭配IHC Select™ 检测试剂，效果更好。徕卡（Leica）也有相应的封闭剂，可用于IHC、ISH的封闭环节。

3.      所选择的抗体不符合实验要求。

因抗原不纯、标本片中含有与靶抗原相似的抗原决定簇等原因造成的非特异性染色只能通过采用高纯度、高效价的抗体、或针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。许多公司，比如BD、Merck Millipore、CST等都提供多种类型的抗体，用于免疫组化。其中，徕卡Novocastra^TM的一抗种类繁多，可以直接使用，不需要摸索最佳稀释度，

4.      一抗浓度过高。这种情况应该适当稀释抗体。

5.      标本染色过程中干涸。

组织变干会造成边缘部分的非特异性染色。修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细，采用DAKO笔或PAP Pen在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也能提高操作速度。

6.      DAB变质、显色时间太长。

DAB的孵育时间和配制方式可以产生某些背景颜色。DAB最好现用现配，如有沉渣应过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力。DAB的显色最好在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。其中Merck Millipore（code：281753-50ML）、Leica的DAB显色剂使用方便，显色效果稳定，可用于细胞或组织在免疫组化或原位杂交时结合的辣根过氧化物酶显色，或者Western等结合有辣根过氧化物酶的膜的显色检测。另外，Leica提供DAB片剂(code：DAB-K)，一片DAB可配制成10ml的工作液，存放时间长、性价比高。

 

二、染色过强

1.    抗体浓度过高或抗体孵育时间过长

稀释抗体，减少抗体孵育时间。

 

2.    孵育温度过高

一般室温20-28℃即可。

 

3.    DAB显色时间过长或DAB浓度过高

严格按照说明配制DAB，显色时间控制在5-10分钟左右。

 

三、染色弱

1.    抗原修复不彻底。

石蜡切片在制作过程中固定剂会封闭抗原，所以封闭之前必须修复抗原，暴露抗原决定簇，以便与抗体结合。否则，样本抗原中可以与抗体结合的位点变少，导致最后相应的显色呈弱阳性。徕卡（Leica）专利的抗原修复试剂可以很好的完成这一环节，最大限度的修复封闭抗原。

 

2.    抗体的稀释度过高

应参照抗体厂家的使用范围，对所使用的一抗进行梯度测试，找出最佳的使用浓度。

 

3.    孵育的温度过低、孵育时间过短。

一般室温20-28℃即可。可以选择37℃孵育30-60分钟或者4℃冰箱过夜。

 

4.    封闭时间过长。

封闭时间过长，抗原中本应该与一抗结合的位点也被封闭掉，导致一抗的结合量减少，最终染色很淡。封闭时间最好不要超过10分钟。