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CST-IHC成功指南

发布日期:2015-05-11  浏览次数:3756  

CST-IHC成功指南

简介
        免疫组化( IHC) 常用于确认肿瘤或其他组织癌变的形态特征。 在保持原组织成分、 细胞特征以及结构的情况下, IHC 利用抗体检测和分析该组织细胞中的蛋白质表达。 化学固定常用中性缓冲福尔马林( neutral buffered formalin, NBF) 或甲醛将细胞内以及细胞间分子相互作用固定在原位。 组织样品在被切成切片以及装入载玻片以供分析之前, 可在固体石蜡中包埋或在低温溶液中进行冷冻保存。 针对不同的样品或检测靶标, 有不同的组织收集、 保存和固定方法。
        IHC 通过结合特异性抗体来识别生物样品中蛋白质的存在以及表达方式。 抗体与其靶点蛋白质表位的精确结合可检测蛋白质中具有高度特异性的氨基酸序列。 抗体也可检测蛋白质的特异翻译后修饰( post–translational modifi cations, PTM) 。磷酸化特异性抗体已用于确定特定信号通路分子以及研究在不同的生物学背景下磷酸化事件中的变化。 近来, 人们研发出了用于检测其他PTMs 的特异性抗体, 这使得研究人员可以监控蛋白质乙酰化、 甲基化或泛素化状态的变化。
        在 Cell Signaling Technology (CST ) 专门从事IHC 的科学家检测了大量的抗体,只推荐了其中最适合应用于IHC 的抗体。 我们的科学家对大量的抗原修复和免疫染色方法进行了检测,确定了IHC 中各抗体的最佳使用条件。 此外, 科学家还研制了IHC 配套试剂, 以加强抗原的检测并改善IHC 操作的有效性。 
        在此, 我们将重点讲述IHC 操作流程中的关键步骤, 并提供数据以支持及解释我们在实验过程中所提的建议。 此外, 我们也将讨论在IHC 实验过程中, 使用经严格验证抗体的至关重要性。最后,本指南列出了CST 科学家内部常用且最适用于与抗体配套使用的IHC 试剂。



经严格验证的抗体的重要性
        一抗在任何IHC 检测中都至关重要, 对数据质量存在直接影响。 质量较差的一抗可对实验结果造成干扰, 导致结果无法解释或存在误解。 某一抗体的单一组织样品阳性染色结果不足以证实其在IHC 中的可用性。 抗体应通过严格的验证过程, 以确保其可精确地检测到靶点。

IHC 验证过程包括:
   运用免疫印迹分析评估交叉反应条带。
   运用已知靶点蛋白表达水平的细胞株制作的石蜡包埋细胞团进行特异性检测, 包括通过磷酸化、乙酰化、剪切等处理方法验证修饰特异性。
    通过磷酸酶处理方法验证磷酸化特异性。
    利用阻断肽验证特异性,并排除Fc介导的结合、生物素背景以及其他非特异性染色。
    对相应的患癌小鼠模型进行特异性检测。
   对已知靶点蛋白表达水平的细胞株产生的异种移植物进行特异性检测, 包括对应药物治疗后靶点表达的调节。
   利用人类组织芯片对各种组织类型进行抗体功能检测。
    在适当的情况下,对新鲜的冷冻组织进行抗体功能检测。

掌控您的IHC检测
        将抗体添加到组织中并获取信号是一件很容易的事情。 但是, 所获得的信号是特异的吗?在任何实验中, 我们都应考虑包含适当的对照。 阳性和阴性对照可使您进一步确定您的抗体检测到预定的靶点。在检测组织之前, 可利用各种细胞株和处理条件在细胞水平上评估抗体性能。 例如, 利用阳性表达和阴性表达的细胞株评估总蛋白抗体的特异性。 此外, 由已知可引发信号变化的生物或化学调节剂处理细胞, 以检测修饰特异性, 如磷酰化、 乙酰化、 剪切等。 经磷酸酶处理后, 可对磷酸化抗体做进一步评估。 此外, 同型对照抗体有助于排除因Fc受体结合或其他蛋白质与蛋白质相互作用引起的一抗的非特异性染色; 同型对照抗体应与检测抗体具有相同的免疫球蛋白类型。

关键步骤:
载玻片制备
        请注意:查阅产品说明书以确定产品是否经过验证可用于石蜡包埋(IHC–P) 或冷冻(IHC–F)样品。 鉴于大多数源自CST 的IHC 适用抗体被用于石蜡包埋样品,所以我们在此将主要对IHC–P 操作流程提出建议。操作步骤的变动将会被酌情指出。
IHC-P:石蜡包埋细胞团和组织
        免疫染色前, 需收集细胞团样品并将其固定于10%的中性缓冲福尔马林(NBF) 中, 以维持细胞形态和抗原表位。 利用自动处理机对样品进行脱水, 并将样品浸润于固体石蜡。 将浸润石蜡的样品置于装有少量液态石蜡的模子中, 将其冷却。 利用切片机获取厚度为4–6 μ m 的样品, 并将其置于有助于样品粘附的带正电荷的载玻片上。关于如何制备贴壁和悬浮细胞的石蜡包埋细胞涂片的所有细节,请参见IHC实验成功指南第 12  页的《细胞涂片制备流程》。对于组织样本而言,IHC 抗体对收集、固定和石蜡包埋步骤的要求因具体组织类型而异。
IHC-F:冷冻组织
        切片前, 应将冷冻组织储存于–80 ℃的温度下,然后包埋入OCT包埋剂。 准备染色时,切片前将组织置于–20 ℃环境中15分钟以平衡组织成分。利用切片机获取厚度为6–8 μ m 的组织, 并将其置于带正电荷的载玻片上。为进一步帮助样品粘附于载玻片上,我们建议在固定前,将载玻片在室温下风干几分钟,以清除所有的残余水分。查阅产品说明书中所推荐的最佳固定剂和固定条件。
载玻片存储
以下内容仅适用于石蜡包埋样品。
       使用最新制备的载玻片以获得最佳结果。 长时间存储可能导致载玻片样品失去抗原性。 该过程会有所不同, 视靶点蛋白质而定。 因为各蛋白质的载玻片存储对染色的影响不明,所以在使用之前,制备新载玻片是最佳方法。如果载玻片必须存储,则将其存储于4℃的无烘烤环境中。
脱蜡/复水
以下内容仅适用于石蜡包埋样品。
        为使抗体结合及染色, 需将石蜡完全清除。 这需要经过一系列的二甲苯/ 乙醇/ 水清洗, 以清除石蜡, 并使组织复水以便于之后的抗体结合。 石蜡清除不彻底可导致染色出现斑点及背景染色不均匀。 如发生该情况, 则需利用新鲜的二甲苯制备新切片以重复实验。 脱蜡和复水步骤完成
后,则需在接下来的操作流程中避免载玻片变干。
抗原修复
以下内容仅适用于石蜡包埋样品。
       因为固定时形成的交联可通过阻止抗体与抗原接触来防止抗体结合; 因此, 需通过抗原修复( 也称为抗原暴露或抗原表位修复) 的过程来逆转交联。抗原修复可通过热诱导的方法(heat–induced epitope retrieval, HIER )或者酶解达到。产品说明书中将明确阐述用于CST™ 抗体的推荐
方法。
热诱导的抗原表位修复 (HIER) 
缓冲液
        适用于HIER 的缓冲液有多种。 而CST常推荐的两种缓冲液是:pH6, 10mM柠檬酸盐缓冲液和pH 8, 1mM EDTA 缓冲液。缓冲液是否适用于您的实验取决于您所使用的一抗。 请查阅产品说明书中所推荐的用于特异性抗体的修复缓冲液。 一般而言, EDTA 缓冲液适用于多数磷酸化酪氨酸特异性抗体, 而柠檬酸盐缓冲液适用于其他多数抗体。每天都需制备新鲜的1X溶液。如图所示,适当的修复缓冲液对最终染色质量具有显著影响。
煮沸装置
        载玻片在所推荐的缓冲液中加热煮沸一段时间后, 才可引起抗原修复。 该步骤通常在微波炉或高压锅中进行。 虽然, 一些研究人员也使用水浴锅, 但是, 因为该步骤中所选择的装置对染色存在积极或消极的影响。 所以, 我们建议使用微波炉或高压锅加热煮沸以达到最佳抗原修复效果。
酶促抗原修复 
       胃蛋白酶、 胰蛋白酶或者蛋白酶K 进行的酶解作用也可达到抗原修复。 一些抗体需要通过酶而非HIER进行修复。 产品说明书中将明确说明所推荐的酶以及酶解条件。

免疫染色
淬灭
        如果您使用的是基于HRP的检测系统, 那么应阻断影响信号强度的内源性过氧化物酶的活性。 一抗孵育前, 将载玻片置于经蒸馏水稀释的3%的过氧化氢(H2O2) 溶液中淬灭10分钟( 对于IHC–F , 在甲醇中稀释H2O2)。
封闭
       在IHC–P 中,我们建议在室温下在含有Tween20  的TBST 缓冲液和 5% 正常山羊血清 (NGS) 中封闭样品,时长1小时,以防止非特异性背景染色。在进行IHC–F 时,在含有 0.3% Triton™ X–100 的 1X TBS和 5% NGS中封闭样品。市售的含有酪蛋白的封闭溶液与磷酸化的一抗结合后易减弱信号;因此, 我们建议不使用含有酪蛋白的封闭剂进行磷酸化特异性抗体的检测。

一抗孵育 
抗体稀释液
        在IHC–P 中, 有多种抗体稀释液可供选择, 但是所选择的抗体稀释剂对染色效果具有显著影响。 在CST , 我们利用SignalStain抗体稀释液、TBST/5% NGS (含5%山羊血清的TBST)或者 PBST/5% NGS(含5 %山羊血清的PBST) 来稀释一抗。 因为合适的稀释剂具有抗体特异性; 因此, 查阅产品说明书中针对使用的抗体所推荐的稀释剂。 在进行IHC–F 过程中, 一抗应在封闭缓冲液(TBS/0.3% Triton™ X–100/5% NGS) 中稀释。
抗体孵育
        我们建议在4 ℃的温度下进行一抗过夜孵育, 此外, 我们所推荐的所有稀释液均基于过夜孵育。 但是, 这并不是说CST 抗体不适用于自动化平台的简短孵育, 而仅仅意味着为获得最佳信号, 要选择最优的方法和试剂。
清洗 
        充分清洗对于获得对比鲜明的低背景和高质量信号至关重要。 一抗孵育和二抗孵育后, 利用TBST 清洗石蜡切片(IHC–P) 或者TBS 清洗冰冻切片(IHC–F),将载玻片清洗三遍,每次为5分钟。

检测
检测系统
        传统的IHC 检测方法利用了亲和素和生物素间的天然亲和性。 这种亲和素–生物素–复合物 (ABC)  系统需要进行两步法检测:包括结合生物素化二抗后暴露于亲和素–HRP 复合物, 然后进行显色反应。 基于生物素的系统容易导致背景染色, 特别是含有大量内源性生物素的肝脏、 肾脏等组织。 因此, 我们建议使用基于聚合物的检测系统,如SignalStainBoost IHC 检测试剂。该基于聚合物的检测系统不含生物素,而包含了直接偶联于聚合物主链上的酶和二抗。SignalStain Boost IHC 检测试剂具有高敏感性并消除因内源性生物素所致的假阳性染色,其检测过程省去一个步骤为检测过程节省了时间,并且其与所有基于过氧化物酶的底物相容。
色原
        二氨基联苯胺 (DAB)  底物是基于过氧化物酶检测系统中最常用的色原之一。 DAB与HRP反应以在抗体结合处形成棕色沉淀物。 在实验中建议始终使用高质量的DAB底物。 在CST 公司, IHC 小组的CST 科学家内部鉴定IHC 抗体所使用的都是SignalStainDAB底物试剂盒。SignalStaia® DAB 底物试剂盒敏感性高,且与一抗的作用效果最佳。在TBST 中清洗 3 x 5 分钟(若为IHC–F ,则在TBS 中清洗 3 x 5 分钟),以清除未结合的二抗,随后将 100–400 μl SignalStain®DAB 应用于每一个组织切片并密切监控以得到合适的显色。一般而言,1–10  分钟即可获得可接受的染色强度。获得合适的染色强度后,将载玻片置于蒸馏水 (dH2O)  中以阻止进一步显色。
复染剂
        抗体检测结束后,多数研究者在封片前倾向于使用复染剂对组织复染, 凸显细胞结构使更有利于观察特异性染色。 目前多种复染剂在市场上均有售。在CST ,我们采用苏木精对样品进行复染,胞核染色呈蓝色。 根据制造商的说明进行复染。 所选的复染剂必须与所使用的色原匹配。 例如, 若复染剂染色颜色与色原颜色过于接近,则难以辨别抗体信号。
脱水、封片、镜检
        切片应使用盖玻片封片, 以保存标本并进行最佳观察。 水性封固剂和非水性( 长期保存) 封固剂皆可使用。 封固剂的选择取决于您在检测时所用的色原以及其在有机溶剂或水中的溶解度; 可溶于乙醇或二甲苯的色原不可与非水性封固剂同用, 溶水的色原不可与水性溶剂同用。使用不合适的封固剂将会弱化细胞信号。我们建议使用DAB底物和非水性封固剂。 非水性封固剂不溶于水; 因此样品必须首先用乙醇和二甲苯进行脱水:
在 95% 乙醇中脱水 2 次,每次 10  秒;在 100%  乙醇中脱水 2 次,每次 10  秒;在 二甲苯中脱水 2 次,每次 10  秒。
        但是, 也有部分研究者要求使用水性封固剂。 尤其在多元分析中, 多个抗体和色原用于同一样品时, 需要使用水性封固剂。 如果使用水性封固剂, 则无需脱水。 封固剂可直接滴在载玻片的一端, 之后再盖上盖玻片。将载玻片轻轻推到显微镜下观察。

来源:CST
www.mintaibio.com