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BD流式试剂选择及应用的相关问答与简介

发布日期:2015-04-16  浏览次数:2995  

BD流式试剂选择及应用的相关问答与简介


一、如何搭配流式抗体荧光标记

流式抗体荧光标记搭配主要由3个因素决定的:流式细胞仪能检测多少个通道、需要同时检测检测多少个指标、厂家的抗体有多少种荧光标记。如果流式细胞仪的通道越多,那么同一份样本能同时做的表面/胞内标志就越多

A、 如何根据流式细胞仪搭配流式抗体

1)BD流式细胞仪  流式细胞仪能检测多少个通道是由有多少根激光决定的以及每根激光的功能决定的,所以首先需要注意两点:流式细胞仪有哪些激光。比如标配的FACSCalibur只有一根488nm的激光,能做FL1、FL2、FL3三个荧光通道/三个颜色,而选配的Calibur (FACSCalibur的简称)配有488nm和635nm两根激光,可以检测FL1-FL4四个通道/4个颜色。不同型号的流式细胞仪的同样的一个通道检测荧光素的能力是不一样的,比如Calibur的FL3(第3通道)能检测PE-Texas Red, PE-Cy5, PerCP, PerCP-Cy5.5, PE-Cy7,而Aria的第3通道只能检测PE-Texas Red, PE-Cy5,PerCP。 Calibur第3通道能检测的PerCP-Cy5.5在FACSAria上是第4通道检测。Calibur和LSR都能检测4个颜色,但是第4个通道检测荧光素是不一样的

搭配荧光素原则

搭配流式荧光素有2个原则:每个通道只能选择1种荧光素;各个通道之间的荧光素可以随意搭配,但需注意
1、每个通道只能选择1种荧光素。以Calibur为例说明,Calibur的FL1通道选择了FITC就不能选择Alexa Fluro488,或者选择了Alexa Fluro488就不能选FITC

Calibur的FL3通道尽管能检测PE-Texas Red, PE-Cy5, PerCP, PerCP-Cy5.5, PE-Cy7五个荧光素,但是我们我们搭配的时候只能选择其中1个。

2、各个通道之间的荧光素可以随意搭配:如果客户的流式细胞仪能做4个通道,在第1个原则之下,那么每个通道随便选出1个荧光素就可以组合成4个颜色。以2跟激光的Calibur为例,Calibur各个荧光素之间可以搭配出16种组合。

比如常用的搭配是FITC(FL1)+PE(FL2)+PerCP(FL3)+APC(FL4),这个搭配组合可以更改成AlexFluro(FL1)+PE(FL2)+PerCP(FL3)+APC(FL4), 或者FITC(FL1)+PE(FL2)+PerCP(FL3)+Alex Fluro(FL4),或者FITC(FL1)+PE(FL2)+PE-Cy5(FL3)+APC(FL4)等等。总之,在第1原则之下,我们可以随意搭配和组合各个荧光素。但是需要注意的是,APC和PE-Cy5一起使用的话,上流式以后,容易导致补偿过度


B、 BD公司抗体有多少种荧光素


1)供应商能提供的每种抗体的荧光素是不一样的

我们需要根据同时结合供应商能提供的每种抗体的荧光素进行搭配。原则上同一个标志的不同的克隆号带同1个荧光素在应用上没有区别的,但是有些不同克隆号的抗体之间可能会有一些稍微的差异,需要仔细看说明书。我们可以尽量选择在说明书上有流式图形的抗体,或者选择荧光素种类最多的克隆号的抗体

2)荧光素
可以登陆www.bdbiosciences.com/spetra,输入荧光素和检测的BD流式细胞仪机型及激发光,就可以查到相应的波长。

为什么要推荐使用Alex Fluro488和Alex Fluro647呢?

因为这些荧光非常明亮,对激光非常稳定,适合流式细胞仪的光谱性质,对PH值不敏感,具有水溶性。此外,他们联合使用时发射光谱存在巨大差异,无需补偿。

C、如果检测的指标数目超过了流式细胞仪的通道,怎么办?

如果需要做5个指标,而流式细胞仪只能做4个通道,首先将指标归成2类,再将样本分成2份,分别检测。比如需要同时检测CD3、CD4、CD8、IL-4和IFN-gamma,那么将样本分成两份,第1份加CD3、CD4、CD8和IL-4,而第2份加CD3、CD4、CD8和IFN-gamma。

二、同型对照(Isotypy Control)

1、为什么要用同型对照?

同型对照是使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白,用于消除由于抗体非特异性与细胞结合而产生的背景染色。同型对照是真正意思上的阴性对照,它不但可以用来设定流式细胞仪的电压,而且还可以帮忙省去昂贵与繁琐的重组细胞因子竞争封闭步骤。在流式细胞仪上样前,染色方式如下:

样本管:一抗+样本
同型对照管:同型对照+样本

2、如何选择同型对照?

一般选择与一抗的成分完全相同种属来源、相同亚型和亚链、相同荧光标记的抗体,比如抗人的CD56 APC标记的抗体,货号是555518,成份是Mouse IgG1,κ。那么它的同型对照应该是APC标记的Mouse IgG1,κ,货号是555751。注意同型对照的成份跟它的名称是相同的.如果是抗体的组合形式是纯化的一抗+荧光标记的二抗,那么应该选择一抗的同型对照。比如CDw125的纯化抗体,货号是555901,成分是Mouse IgG1,κ。它的同型对照是纯化的Mouse IgG1,κ,货号是555746。它的二抗PE标记的抗小鼠IgG1,货号是550083。那么染色方式如下:

样本管:纯化的CDw25+PE标记的抗Mouse IgG1+样本

同型对照管:纯化的同型对照+PE标记的抗Mouse IgG1+样本

如果没有找到适合的同型对照,在保持来源相同、荧光标记相同、免疫球蛋白类别相同条件下,那么优先选择的顺序应该是亚链不同--亚型不同--相同类别。比如,某种的抗体的来源是MouseIgG2а,κ。如果在同型对照表里面找到不到完全相同的同型对照,那么优先选择相同荧光标记的Mouse IgG2а为同型对照。如果也没有找到Mouse IgG2а,那么优先选择相同荧光标记的Mouse IgG2b作为同型对照。如果最后还是没有找到MouseIgG2b,那么选者相同荧光标记的Mouse IgG2作为同型对照。

3、如何查找同型对照?

同型对照在BD英文目录中或者BD网站上跟它对照的抗体的位置是一致的。BD目录中,抗人的抗体的同型对照都在HUMAN章节后面。抗小鼠的抗体的同型对照在MOUSE章节后面,非人类灵长类的抗体同型对照在NON HUMAN PRIMATE章节后面。由于抗大鼠的抗体非常少,大部分抗体都是小鼠来源的,所以它的同型对照跟小鼠的一样,放在MOUSE章节后面。胞内细胞因子、趋化因子、补体、炎症介质及其受体的同型对照放在其章节的后面(注意:人的胞内细胞因子的同型对照跟人的表面标志的同型对照是不在一起的)。Phosflow的同型对照在Phosflow的介绍后面。比如,比如抗人的CD56 APC标记的抗体,货号是555518,在06版BD目录的169页,成份是MouseIgG1,κ。那么它的同型对照应该是在HUMAN章节中Mouse Immunoglobulin Isotype表格中,第191页,APC标记的Mouse IgG1,κ,货号是555751。

4、哪些客户需要使用同型对照?

A 对流式不是非常熟悉的客户。

B做胞内流式客户,比如胞内细胞因子、趋化因子和信号蛋白等。

C使用不常见的标志或者特异性不高的标志的客户,因为客户不熟悉不常见标志的表达情况,根据同型对照可以判断阳性细胞的位置。一些特异性不高的抗体,如多抗,非特异性结合非常多,使用同型对照可排除假阳性。

D 对流式非常熟悉又使用常用的表面标志的客户
一般可以不使用同型对照。

5、为什么有时候同型对照的表达会比抗体的表达高?

首先需要检查同型对照的抗体是否加错类型、剂量等。其次,因为有些标志在细胞的表面或者胞内表达不高,而跟其类似的抗原非常多,那么加入同型对照时,同型对照非特异性的结合会超过抗体的特异性,所以会造成这种现象,在细胞表面时如图所示。这个时候推荐使用其他阴性对照,如空白对照等。


三、流式辅助试剂

1、辅助Buffer
A、 BD Phosflow辅助试剂


详情请参见http://www.bdbiosciences.com/pdfs/manuals/05-790030-3A1.pdf以及相关抗体的说明书。

B、产品介绍:(示例)


1)Lysis Buffer (10X concentrate)可以裂解HU、NHP、MS、RAT的红细胞,大致可以处理 500份样本,使用时稀释成1x,PH值务必调整到7.1-7.4

2)BrefeldinA(GolgiPlug)和Monensin(GolgiStop)
Brefeldin A(GolgiPlugTM):破坏高尔基体形成,抑制细胞因子的分泌;Monensin(GolgiStop):抑制细胞因子穿过细胞膜分泌到胞外

在用刺激剂活化细胞的同时,必须用Brefeldin A(GolgiPlug)和Monensin(GolgiStop),但是由于monensin和brefedin A具有时间和剂量依赖的细胞毒性,因此处理细胞的时间不能过长。还需要注意的是:蛋白转移抑制剂还可能影响细胞表面标志的表达,如GolgiPlug使CD14表达下调。

GolgiPlug (Brefeldin A):用于TNF-a 最好,用于小鼠 IL-6, IL-12, MCP-1较好,可使染色背景较低

GolgiStop (Monensin):检测LPS刺激人PBMC产生的 IL-10,适于 IL-4和PMA+Iono刺激4小时的人PBMC(除TNF-a),对于较长时间刺激的细胞检测 IL-3, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13效果更好

3)Stain Buffer

主要是FBS和BSA两种,原则上没有什么区别,一般情况下用FBS,或者PBMC用FBS,如果遇到特殊细胞,则推荐BSA

4)刺激剂 Leukocyte Activation Cocktail, with BD GolgiPlug (Cat.No.550583)主要成份是PMA、Ionomycin和Brefeldin A

T细胞刺激剂:固定CD3和可溶性CD28 HU: Cat.No.555336+555725 MS:Cat.No.553057+ 553294

其他:重组和纯化的细胞因子、细胞

5) FC受体阻断剂 

MS Fc gammaII/III(Cat.No.553141/2)

HU 10%的正常human serum

2、补偿微球

流式细胞仪的荧光补偿隔一段时间之后需要调整到适合的位置。如果荧光补偿没有调节好,会导致细胞分群不明显或者流式检测得到的结果图非常不漂亮,而且会影响到检测结果的不真实。荧光补偿的调节对初学者来说非常不容易掌握,同时,补偿调节是流式细胞术中比较难掌握的操作。尤其是一些不常见的标志检测时,需要经验非常丰富的流式操作者根据多年的经验判断调节补偿,才可以得到比较好的数据和图片。那么,现在不需要这么麻烦。因为补偿微球让一切变得更简单。BDTM CompBeads是专用于流式细胞仪多色分析的荧光补偿调整微球。它的实用性是在于克服了以往普通的做三色以上的流式分析时补偿难调、耗费样本(往往用待测样本单标来进行补偿调节)的缺点。它本身不携带任何荧光,借助于与客户自己的特异性荧光抗体孵育结合来调节补偿。它不但能象待测的样本细胞一样在同样的实验条件下固定、破膜等,操作起来很简单,灵敏度高,一致性好,使补偿更轻松更准确,而且最难得的是它最适合于多色分析(如五色、六色、七色等)和复合荧光素(如PE-Cy7、APC-Cy7等),因为这时的补偿往往难度较大。各型号的流式仪器均能使用。Compbeads使用后可以将流式的条件保存,方便下次做同样的荧光染色搭配时参考用。

3、Positive Control Cell是一系列激活的、固定好的、未打孔的细胞,可以作为胞内染色的阳性对照细胞

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