BD CBA原理及选用方法
BD CBA原理及选用方法
Cytometric Bead Assay（CBA），即微量样本多重蛋白定量技术，是一个基于流式细胞检测系统的多重蛋白定量检测方法。它能够同时对单个样品中的多个指标进行检测。日常实验中，常需对溶液体系中的可溶性蛋白进行定量检测，如细胞培养上清或血清血浆中的细胞因子含量的定量分析。由于这些因子的含量较少，低于一般常规方法的检测下限，使用传统的蛋白检测方法很难检测。同时由于样本量少，一次只检测一个因子的方法难以实现多个因子的检测，而且费时。BD公司利用流式细胞仪对荧光信号检测的高灵敏性，以及同时可区别多种荧光及多种荧光强度的特性，将受检的可溶性因子附着于一些具有近似细胞直径的微粒上，即可对受检样品中的多种可溶性因子进行检测。为些，BD公司开发了微量样本多重蛋白定量系统，简称CBA系统。首先利用一系列带有荧光标记的微球连结特定的捕获抗体以捕捉溶液系统中的待测物，然后再通过相对应的各种不同检测物特异微球上的不同荧光强度同时定量测定分析样本中多种可溶性成分。
BD的CBA系统的工作原理简单，对应受检系统中的每一个检测指标都有不同的捕获微球（图1）。不同的捕获微球上包被有特异的捕获抗体，并具有不同的荧光强度。捕获微球与待测样品溶液混合后，微球上的特异性抗体首先与样品（血清、血浆或细胞培养液）中的相应抗原或蛋白结合。然后，与加入的荧光标记的检测抗体形成“三明治”夹心复合物，通过流式细胞仪进行荧光检测。对样品中的各检测因子的含量进行分析。
图1 BD CBA原理示意图
BD CBA技术用于多重分析，单个样品即可获得更多数据。尤其是在样品量少的情况下，多重检测将可分析蛋白种类最大化。应用BD CBA技术，最高可分析30种蛋白，仅需25到50µl样品。其它方法如ELISA和Western Blot用相同样品量只能检测一种蛋白。
BD CBA技术有两种形式供不同需求：
一、BD CBA Flex Sets（开放、自由组合、灵活）：
BD CBA Flex Sets系统提供微球试剂的自由组合菜单，轻松实验多重检测，检测指标包括人、小鼠、大鼠的细胞因子、趋化因子和生长因子等可溶性蛋白；人免疫球蛋白；磷酸化细胞信号蛋白。
特点：
——在配置有488nm或532nm和633nm激光的流式细胞应用BD CBA Flex Set系统最多可以同时检测30种蛋白。
——每一类产品都有特定的缓冲液试剂盒（Master Buffer Kit）。所有产品均经过单个指标和多种指标的性能验证，以确保数据的一致性。
——检测抗体用PE直接标记，而非链酶亲和素-PE检测方法，PE直接检测试剂将血清和裂解样品中内源性生物素引起的噪音干扰减至最小。
——BD CBA细胞信号Flex Set扩展了研究才对细胞信号通路的研究。检测涵盖B细胞和T细胞受体信号转导的关键信号分子，以及免疫反应中其他信号通路，如生长因子受体和MAP激酶信号转导通路。
——检测系统包括一个重组蛋白标准品作为内参，生成一条标准曲线用于定量分析。对于每一种检测蛋白，分析软件可以自动生成对应的Units/ml定量数值，不需要额外的步骤即可得到结果要。低CVs值，研究者对实验结果更有信心。
操作步骤：
1、选择人、大鼠、小鼠或细胞信号BD CBA Flex Set；
2、选择100或500tests的BD CBA Flex Set Master Buffer Kit；
3、按照Master Buffer Kit操作指南上的说明进行操作；
4、在双激光流式细胞仪上获取样品；
5、应用FCAP Array多重检测软件进行数据分析。
二、BD CBA Kit（常规组合，一致性结果）：
BD CBA试剂盒可以对复杂的生物学样本在流式平台进行多重检测。根据生物学领域（如，Th1/Th2或炎症细胞因子）预先固定组合，利用含有特定数量红色染料的捕获微球同时检测7种蛋白。
特点：
——染料独特的光谱特征决定了样本可以在配置有单激光（488nm）或双激光（488nm或532nm和633nm）的流式细胞仪上进行检测。
——每种试剂盒包含检测80个样本需要的所有缓冲液和试剂。
——每一种试剂均经过严格的方便使用、快速数据分析，敏感性、可重复性和质量等方面的测试。
——额外的选择，增加灵活性。BD CBA微球是未包被的微球，研究者可应用sulfo-SMCC化学试剂将自己感兴趣的抗体或蛋白与之结合。包被过程只需常规实验室用品和BD CBA功能微球结合缓冲液试剂盒中的缓冲液，不到4个小时即可完成。
三、现有CBA Kit产品：
Human Anaphylatoxin Kit C4a, C3a, C5a | Human Chemokine Kit IL-8, RANTES, MIG, MCP-1, IP-10 | Human Inflammation Kit IL-8, IL-1b, IL-6, IL-10, TNF, IL-12p70 |
Human Th1/Th2/Th17 Kit IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF, IFN-g,IL-17A | Human Th1/Th2 Cytokine Kit IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF, IFN-g | Human Th1/Th2 Cytokine II Kit IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF, IFN-g |
Mouse Inflammation Kit IL-6, IL-10, MCP-1, IFN-g, TNF, IL-12p70 | Mouse Th1/Th2 Cytokine Kit IL-2, IL-4, IL-5, IFN-g, TNF | Mouse Immunoglobulin Isotyping Kit Heavy and light chain isotypes of IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, IgM, IgE |
Mouse Th1/Th2/Th17 Kit IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF, IFN-g,IL-17A | Non-human Primate Th1/Th2 Cytokine Kit IL-2, IL-4, IL-5, IL-6,TNF, IFN-g | Human Inflammation Lyophilized Standards IL-8, IL-1b, IL-6, IL-10, TNF, IL-12p70 |
Human Th1/Th2 Cytokine Lyophilized Standards IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, TNF, IFN-g | Mouse Inflammation Lyophilized Standards IL-6, IL-10, MCP-1, TNF, IFN-g, IL-12p70 | Mouse Th1/Th2 Cytokine Lyophilized Standards IL-2, IL-4, IL-5, IFN-g, TNF |
四、现有CBA Flex Set产品（细胞因子、炎症因子、趋化因子）：
人 | 小鼠 | 大鼠 | |
IFN-γ,INF-α IL-1 α ,IL-1β, IL-2,IL-3, IL-4 , IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-12p70, IL-13, IL-17A, IL-21, IL-23p40 TNF,TNFRⅠ,TNFRⅡ IP-10 I-TAC MIG MCP-1 MIP-1 α, MIP-1 β Eotaxin RANTES CD54(ICAM-1) CD62E,CD62P,CD62L CD106(VCAM-1) sCD40 sCD154(CD40 Ligand) | sCD121a,sCD121b Soluble CD14 Basic FGF VEGF Angiogenin G-CSF,GM-CSF LIF LT-α OSM Granzyme A, Granzyme B Fas Ligand(FasL) Fractalkine IgA, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, Total IgG, | IFN- γ IL-1 α ,IL-1β, IL-2,IL-3, IL-4 , IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12, IL-12p70, IL-13, IL-17A, IL-21, IL-23p40, TNF MIG MCP-1 MIP-1 α, MIP-1 β RANTES KC CD62E(E-Selectin), CD62L(L-Selectin) G-CSF,GM-CSF | IFN- γ IL-1 α, IL-4 , IL-6, IL-10 TNF |
五、现有CBA Flex Set产品（信号蛋白）：
Phospho Akt1(S473) | Phospho Akt2(S474) |
Phospho BLNK (Y84) | Phospho p120 Catenin(Y228) |
Phospho Btk (Y551) | Phospho MEK1/2(S222) |
Phospho eNOS (S1177) | Phospho Paxillin(Y118) |
Phospho ERK1/2 (T202/Y204) | Phospho Pyk2(Y402) |
Phospho Itk (Y511) | Phospho SLP-76(Y145) |
Phospho JNK1/2 (T183/Y185) | Phospho c-jun(S63) |
Phospho p38 (T180/Y182) | Phospho stat3 |
Phospho PLCg (Y783) | |
Phospho Rsk (T573) | |
Phospho Stat1 (Y701) | |
Phospho Syk (Y352) | |
Phospho ZAP70 (Y319) | |
Total Stat1 | Human Rex-1 Flex Set |
Total Syk | Human Oct-4 Flex Set |
Total ZAP70 | Human Nanog Flex Set |
六、产品信息：
产品名称 | 规格 | 货号 | 包含因子 |
Human Th1/Th2/Th17 Kit | 80次 | 560484 | IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF, IFN-γ, IL-17A |
Human Chemokine Kit | 80次 | 552990 | CXCL8/IL-8, CCL5/RANTES, CXCL9/MIG, CCL2/MCP-1, CXCL10/IP-10 |
Human Anaphylatoxin Kit | 80次 | 561418 | C4a, C3a, C5a |
Mouse Inflammation Kit | 80次 | 552364 | IL-6,IL-10, MCP-1, IFN-γ, TNF, IL-12p70 |
Human Inflammatory Cytokine Kit | 80次 | 551811 | IL-8, IL-1β, IL-6, IL-10, TNF, IL-12 p70 |
Non-human Primate Th1/Th2 Cytokine Kit | 80次 | 557800 | IL-2,IL-4, IL-5, IL-6, TNF, IFN-γ |
Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit | 80次 | 560485 | IL-2, IL-4, IL-6, IFN-γ, TNF, IL-17A, IL-10 |
Human Th1/Th2 Cytokine Kit | 80次 | 550749 | IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF, IFN-γ |
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