ChIP技术总结

（一）、关于细胞

细胞的生长状态直接影响细胞内部的基因表达调控网络，也很有可能影响所研究的TF与其靶Promoter的结合。一般细胞长到75％－80％比较好。

 

（二）、关于交联

甲醛能有效的使蛋白质-蛋白质，蛋白质-DNA，蛋白质-RNA交联，形成生物复合体，防止细胞内组分的重新分布。甲醛的交联反应是完全可逆的，便于在后续步骤中对DNA和蛋白质进行分析。交联所用的甲醛终浓度为1%，交联时间通常为5分钟到1个小时，具体时间根据实验而定。值得注意的是，交联时间如果过长，细胞染色质难以用超声波破碎，增加背景，影响ChIP结果，而且实验材料也容易在离心过程中丢失。交联时间如果过短，则交联不完全，产生假阴性。甲醛的交联反应可被甘氨酸终止。交联条件和细胞类型也有一定关联。不同的细胞系，交联的条件也不一样。例如：NIH－3T3的交联条件是室温（25℃）15min，1％的甲醛浓度，而别的细胞系则可能完全不一样。

 

（三）、关于超声破碎

超声破碎的条件，机器不一样，条件也不一样。一般，理想的超声破碎得到的片段大小是200bp－1000bp。交联后的染色质可被超声波或Micrococcal Nuclease切成400~600 bp的片段（用琼脂糖凝胶电泳检测），以便暴露目标蛋白，利于抗体识别。超声波是使用机械力断裂染色质，容易引起升温或产生泡沫，这都会引起蛋白质变性，进而影响ChIP的效率。所以在超声波断裂染色质时，要在冰上进行，且要设计时断时续的超声程序，保证低温。另外，超声探头要尽量深入管中，但不接触管底或侧壁，以免产生泡沫。总超声时间也不要太长，以免蛋白降解。

Millipore公司有商品化的Micrococcal Nuclease处理的ChIP试剂盒（EZ-Enzyme），与超声波处理相比，Micrococcal Nuclease可以将染色质切成一到几个核小体，结果更精致，更均一。另外，酶反应的条件比较温和，对DNA和DNA-蛋白复合物的损伤较小，而且蛋白不易变性。酶处理染色质适用于新鲜的细胞或组织样品和冰冻样品及组蛋白研究。

 

（四）、关于Beads

利用目的蛋白的特异抗体通过抗原-抗体反应形成DNA-蛋白质-抗体复合物，然后使用Agarose beads或Magna beads沉淀此复合物，特异性地富集与目的蛋白结合的DNA片段。再经过多次洗涤，除去非特异结合的染色质后，用SDS+NaHCO₃洗脱免疫沉淀复合物。

Magna beads使用起来方便，不像Agarose beads那样容易破裂，操作过程更简单，而且免去了离心，节省不少时间，一天就可以完成ChIP实验，适合高通量实验。

CST提供ChIP级别的Protein G Agarose beads（目录号：9007）和Protein G Magna beads（目录号：9006），其中，Protein G Magna beads需配合磁力架一起使用（目录号：7017）。 

另外，Merck Millipore公司也有多种ChIP级别Magna beads（目录号：16-662、16-663X）以及相应磁力架（目录号：20-400）。

 

（五）、关于抗体

   抗体是实验成败的致命因素之一！单抗与多抗各有利弊。单抗特异性强，背景低，但是识别位点单一，而在ChIP甲醛交联的过程中，很有可能该位点被其它蛋白或核酸结合而被封闭，导致单抗不能识别靶蛋白。多抗虽然没有这个问题，但是多抗特异性较差，背景可能会偏高。所以，应尽可能的选择高品质抗体。比如Abcam、CST、Millipore、BD等多家公司都提供ChIP级别的抗体，经过严格的实验室检测，确保效率及实验结果的可靠性，推荐使用。

 

（六）、关于解交联和DNA片段的纯化

用不含DNase的RNase和Proteinase K，65℃保温6小时逆转交联，经DNA纯化柱回收DNA或用酚氯仿抽提、乙醇沉淀纯化DNA。DNA纯化柱纯化DNA的质量高，有利于下一步PCR等方法的检测。甲醛不仅交联DNA-蛋白质，还交联蛋白质-蛋白质，所以还可以对DNA序列上的蛋白质复合物进行分析。在逆转交联时不使用Proteinase K，然后用丙酮回收有机相中的蛋白质，进行分析。

Merck Millipore现推出ChIP Ab+抗体引物套装，性价比高，包括：阴性对照抗体，保障ChIP反应的特异性；qPCR对照引物，用于检验ChIP结果。CST也有多种ChIP抗体和引物组合，供您选择。

小Tip：过柱前，在样品中加入一定量的异丙醇，能有效的消除SDS沉淀。

 

（七）、阳性与阴性对照

在做ChIP实验时，一定要做好实验对照，没有对照，很难对实验结果的可靠性进行评估。阳性抗体和阴性抗体对照是最基本的实验对照，阳性抗体通常选择与已知序列相结合的比较保守的蛋白的抗体，常用的包括组蛋白抗体或RNA PolymeraseII 抗体等；阴性抗体通常选择目的蛋白抗体宿主的IgG。目的蛋白抗体的结果与阳性抗体和阴性抗体的结果相比较，才能得出正确结论。另外，还应考虑目的蛋白抗体与DNA 的非特异性结合的可能，所以通常还会选择数对阴性引物，即目的蛋白肯定不会结合的DNA 序列，作为该抗体的阴性对照。

 

（八）Input对照

在进行免疫沉淀前，需要取一部分断裂后的染色质做Input对照。Input是断裂后的基因组DNA，需要与沉淀后的样品DNA一起经过逆转交联，DNA纯化，以及最后的PCR或其他方法检测。Input对照不仅可以验证染色质断裂的效果，还可以根据Input中的靶序列的含量以及染色质沉淀中的靶序列的含量，按照取样比例换算出ChIP的效率，所以Input对照是ChIP实验必不可少的步骤。

目前，许多公司都提供ChIP完整的配套试剂盒，为您的实验提供很多便利。推荐几家，比如Merck Millipore公司的EZ-ChIP试剂盒及Magna-ChIP试剂盒（17-610、17-611）。其中EZ-ChIP试剂盒（目录号：17-408、17-409）不仅提供普通ChIP试验所需的试剂（甲醛溶液，无机盐缓冲液除外），还提供阴性抗体、阳性抗体对照及DNA纯化柱，使您的试验更为可靠、高效。注：该试剂盒不含抗体，需要用户自行选择ChIP级抗体。

另外，CST公司也相继推出几款ChIP试剂盒，如The SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads 目录号：9002、Magnetic Beads目录号：9003）和SimpleChIP™ ChIP Kits 是由 CST 和 NEB 共同研发，基于酶解的新一代染色质免疫沉淀检测试剂盒。该试剂盒包含ChIP验证的抗体和ChIP级别的Protein G琼脂糖珠/磁珠，其中的DNA纯化柱可以直接高效回收DNA、去除蛋白，而免去苯/氯仿抽提和乙醇沉淀。