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免疫组化关键环节剖析

发布日期:2012-11-08  浏览次数:3177  

免疫组化关键环节剖析

免疫组化关键环节剖析

1、酶免疫组化的关键环节

1)标本固定:固定的目的是①防止标本从玻片上脱落;②除去防碍抗原-抗体结合的类脂,使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果;③固定的标本易于保存。固定剂的选择一般用4%多聚甲醛。

2)脱水、石蜡包埋和制片:脱水用梯度乙醇(由低到高)充分脱水、对组织要完全浸蜡、切片时刀片要干净和锋利。否则,容易裂片和脱片等。

3)脱蜡和水化:为了后面的抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应,需对切片进行脱蜡。脱蜡可以先6020min,然后立即二甲苯1-3分别10min(这个时间是由二甲苯新鲜程度和室温等综合决定的),但当天制好的切片一般先603-4h。水化用梯度乙醇(由高到低)。若脱蜡和水化不全,易出现局灶性反应和浸洗不全,而产生非特异性背景着色。

4)抗原修复:由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中,发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用,从而失去抗原性;通过抗原修复,使得细胞内抗原决定族重新暴露,提高抗原检测率。常用的修复方法从强到弱一般分为三种,高压修复、微波修复、胰酶修复。其中,徕卡(Leica)的NovocastraTM抗原修复液(code:AR9640AR9961适用于对福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片进行热引导的抗原修复(HIER) ,不同的HIER方式结合不同PH值的抗原修复液,得到最好的抗原暴露效果。

5)细胞通透:目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用Triton X-100、蛋白酶k等通透液。如Triton X-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内,故在细胞免疫组化时尤为推荐使用,这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。在免疫组织化学(>10um厚切片) 和免疫细胞化学中一般用Triton X-100 作为细胞通透剂,在膜上打孔。同时也是一种去污剂,一般在PBS中加入后终浓度是0.05%即可,而前者终浓度是0.5%-1%。石蜡切片4um左右可以不通透,因为细胞已经被切开了。

6)灭活内源性过氧化物酶和生物素:在传统的ABC法和SP法中,免疫组化反应结果容易受到内源性过氧化物酶和生物素的干扰,必须用过氧化氢和卵白素等进行灭活。灭活内源性POD3%过氧化氢灭活时间短点,可以10min左右,而0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间,一般10-30min

7)血清封闭:组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合,造成后续结果的假阳性;封闭血清一般是和二抗同一来源的,血清中动物自身的抗体,预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合;也可以用小牛血清、BSA、羊血清等,但不能与一抗来源一致。一般室温10-30min,也要防止封闭过度。

8)一抗和二抗浓度和孵育时间:一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要,包括孵育时间、温度和抗体浓度。一抗孵育温度有几种:4度、室温、37度,其中4度效果最佳,但时间最好超过16~24h;孵育时间与温度、抗体浓度有关,一般371-2h,而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min,具体条件还要摸索。二抗孵育条件:二抗一般室温或3730min-1h,具体时间需要摸索。而浓度一般有工作液,若是浓缩液还要摸索浓度。但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下,然后去摸索一抗浓度和孵育时间。

9)抗体稀释液:其实许多实验室抗体稀释液就用一般PBS即可,但专用的抗体稀释液中除PBS成份外,还加了叠氮化钠防腐剂、BSA稳定剂等组份,对抗体的多次回收利用较好。比如BD公司的即用型抗体稀释液(code559148),适用于丙酮固定、甲醛固定、石蜡切片、冰冻切片等各种组织、细胞类型。徕卡NovocastraTM的抗体稀释液(codeRE7133用于稀释免疫组化中的一抗、生物素标记的二抗等;而Bond™一抗稀释液(codeAR9352)专门用于BOND™系统的个人化一抗。除此之外,Merck Millipore也有用于石蜡切片免疫组化的抗体稀释液(code21544)。

值得一提的是,徕卡NovocastraTM的一抗种类繁多,可以直接使用,不需要摸索最佳稀释度,消除了稀释误差,提高可重复性。另外,Merck MilliporeBDCST也提供多种类型、高品质的抗体。

10)切片清洗(浸洗、冲洗和漂洗):为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色,一般在一抗孵育前清洗3min*3次,一抗孵育后清洗5*5min

注意:①单独冲洗,防止交叉反应造成污染。②温柔冲洗,防止切片的脱落。③冲洗的时间要足够,才能彻底洗去结合的物质。④PBSPH7.4-7.6浓度0.01M左右。中性及弱碱性条件(PH7-8)有利于免疫复合物的形成,而酸性条件则有利于分解;低离子强度有利于免疫复合物的形成,而高离子强度则有利于分解)

11DAB显色:背景的深浅和特异性染色的深浅均可以由DAB孵育条件决定。DAB显色时间不是固定的,显微镜下控制显色时间,出现特异性染色较强而本底着色较浅时即可冲洗。DAB显色时间很短(如几秒或几十秒)就出现很深的棕褐色,这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长,需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间;此外,若很短时间就出现背景很深,还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全,需要延长封闭时间;DAB显色时间很长(如超过十几分钟)才出现阳性染色,一方面可能说明抗体浓度过低或孵育时间过短(最好一抗4度过夜),另一方面就是封闭时间过长。

12)复染:目的是形成细胞轮廓,从而更好地对目标蛋白进行定位,常用苏木素复染(胞核染料)。注意苏木素复染时间要看当时的室温、溶液的新旧、目标抗原的定位等情况,一般数秒-数分钟,胞浆蛋白可以适当时间长一点,而胞核蛋白则要短。徕卡Leica的苏木精(codeRE710725ml仅需26.5元,实惠的同时还保证复染效果,不妨一试。Merck Miliipore也提供各种规格的苏木精(code104302002510430201001043021000,供您选择。

染色不理想的补救方法:染色深则分化时间稍长些即可;染色浅则再置于苏木素中染色即可。盐酸酒精是分化,氨水是返兰,作用不同。片子复染完后流水振洗,然后置于盐酸酒精中数秒(一定动作要快)后拿出流水振洗,在放入氨水中返兰即可。

13)封片:为了长期保存,一般用中性树胶等封片。可直接在载玻片组织上滴一滴封片液,然后一手拿住盖片某一拐角,而另一手拿对面的那个拐角,接近封片液近端的拐角先降低,直至接触到液体时为止;当发现液体接触面在不断弥散时,则可以缓慢降低另一拐角,这样一般不会产生气泡。

 

2、免疫荧光方法中的重要环节

1)冰冻切片制备:建议用新鲜组织,否则组织细胞内部结构破坏,易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等,防止裂片和脱片严重。

2)组织切片固定:切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进行固定5-10min,尤其要较长时间保存的白片,一定要及时固定和适当保存。

3)血清封闭:为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合,需要在一抗孵育前先用血清(与二抗来源一致)封闭,减弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的,一般10-30min

4)一抗孵育条件:在免疫组化反应中,孵育时间和抗体浓度最重要。一抗孵育温度有几种:4度、室温、37度,其中4度效果最佳;孵育时间与温度、抗体浓度有关,一般371-2h,而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min,具体条件需要摸索。

5)二抗孵育条件:二抗一般室温或3730min-1h,而浓度一般有工作液,若是浓缩液还要摸索浓度,切记要避光反应。但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下,然后去摸索一抗浓度和孵育时间。

6)复染:目的是形成细胞轮廓,从而更好地对目标蛋白进行定位。一般常用DAPI复染。Merck Miliipore有一款即用型DAPIcodeS7113,其中DAPI是溶解在Antifade中,Antifade可以防止荧光信号过快地淬灭,从而得到较好的染色效果。

7)封片:为了长期保存,一般用缓冲甘油等封片。目前市场上多家公司都提供专门的抗荧光萃灭封片液,封闭效果很好。

8)切片清洗:为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色,适当地加强清洗(延长时间和增多次数)尤为重要,一般在一抗孵育前清洗3min*3次,一抗孵育后的清洗均为5*5min

注意:

1)单独冲洗,防止交叉反应造成污染。

2)温柔冲洗,防止切片的脱落。

3)冲洗的时间要足够,才能彻底洗去结合的物质。

4PBSPH和离子强度的使用和要求:建议PH7.4-7.6浓度0.01M。中性及弱硷性条件(PH7-8)有利于免疫复合物的形成,而酸性条件则有利于分解;低离子强度有利于免疫复合物的形成,而高离子强度则有利于分解。

5)拍照:有条件的话最好立即拍照,若不能及时拍照,也要封好片和用指甲油封固,保持避光和湿度。使用荧光显微镜注意严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作,不要随意改变程序;应在暗室中进行检查;防止紫外线对眼睛的损害,在调整光源时应戴上防护眼镜;检查时间每次以1-2h为宜,超过90min,超高压汞灯发光强度逐渐下降,荧光减弱;标本受紫外线照射3-5min后,荧光也明显减弱或褪色;激发光长时间的照射,会发生荧光的衰减和淬灭现象,所以最多不得超过2-3h;荧光显微镜光源寿命有限,标本应集中检查,以节省时间,保护光源。灯熄灭后欲再启用时,须待灯光充分冷却后才能点燃。

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