免疫组化关键环节剖析

1、酶免疫组化的关键环节

1）标本固定：固定的目的是①防止标本从玻片上脱落；②除去防碍抗原-抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；③固定的标本易于保存。固定剂的选择一般用4%多聚甲醛。

2）脱水、石蜡包埋和制片：脱水用梯度乙醇（由低到高）充分脱水、对组织要完全浸蜡、切片时刀片要干净和锋利。否则，容易裂片和脱片等。

3）脱蜡和水化：为了后面的抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应，需对切片进行脱蜡。脱蜡可以先60度20min，然后立即二甲苯1-3分别10min（这个时间是由二甲苯新鲜程度和室温等综合决定的），但当天制好的切片一般先60度3-4h。水化用梯度乙醇（由高到低）。若脱蜡和水化不全，易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。

4）抗原修复：由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。其中，徕卡（Leica）的Novocastra^TM抗原修复液（code:AR9640、AR9961）适用于对福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片进行热引导的抗原修复(HIER) ，不同的HIER方式结合不同PH值的抗原修复液，得到最好的抗原暴露效果。

5）细胞通透：目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用Triton X-100、蛋白酶k等通透液。如Triton X-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。在免疫组织化学（>10um厚切片） 和免疫细胞化学中一般用Triton X-100 作为细胞通透剂，在膜上打孔。同时也是一种去污剂，一般在PBS中加入后终浓度是0.05%即可，而前者终浓度是0.5%-1%。石蜡切片4um左右可以不通透，因为细胞已经被切开了。

6）灭活内源性过氧化物酶和生物素：在传统的ABC法和SP法中，免疫组化反应结果容易受到内源性过氧化物酶和生物素的干扰，必须用过氧化氢和卵白素等进行灭活。灭活内源性POD，3%过氧化氢灭活时间短点，可以10min左右，而0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般10-30min。

7）血清封闭：组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性；封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。一般室温10-30min，也要防止封闭过度。

8）一抗和二抗浓度和孵育时间：一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间、温度和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳，但时间最好超过16~24h；孵育时间与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min，具体条件还要摸索。二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索。而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度。但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。

9）抗体稀释液：其实许多实验室抗体稀释液就用一般PBS即可，但专用的抗体稀释液中除PBS成份外，还加了叠氮化钠防腐剂、BSA稳定剂等组份，对抗体的多次回收利用较好。比如BD公司的即用型抗体稀释液（code：559148），适用于丙酮固定、甲醛固定、石蜡切片、冰冻切片等各种组织、细胞类型。徕卡Novocastra^TM的抗体稀释液（code：RE7133）用于稀释免疫组化中的一抗、生物素标记的二抗等；而Bond™一抗稀释液（code：AR9352）专门用于BOND™系统的个人化一抗。除此之外，Merck Millipore也有用于石蜡切片免疫组化的抗体稀释液（code：21544）。

值得一提的是，徕卡Novocastra^TM的一抗种类繁多，可以直接使用，不需要摸索最佳稀释度，消除了稀释误差，提高可重复性。另外，Merck Millipore、BD、CST也提供多种类型、高品质的抗体。

10）切片清洗（浸洗、冲洗和漂洗）：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，一般在一抗孵育前清洗3min*3次，一抗孵育后清洗5次*5min。

注意：①单独冲洗，防止交叉反应造成污染。②温柔冲洗，防止切片的脱落。③冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。④PBS的PH在7.4-7.6，浓度0.01M左右。中性及弱碱性条件（PH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解）

11）DAB显色：背景的深浅和特异性染色的深浅均可以由DAB孵育条件决定。DAB显色时间不是固定的，显微镜下控制显色时间，出现特异性染色较强而本底着色较浅时即可冲洗。DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4度过夜），另一方面就是封闭时间过长。

12）复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位，常用苏木素复染（胞核染料）。注意苏木素复染时间要看当时的室温、溶液的新旧、目标抗原的定位等情况，一般数秒-数分钟，胞浆蛋白可以适当时间长一点，而胞核蛋白则要短。徕卡Leica的苏木精（code：RE7107）25ml仅需26.5元，实惠的同时还保证复染效果，不妨一试。Merck Miliipore也提供各种规格的苏木精（code：1043020025、1043020100、1043021000），供您选择。

染色不理想的补救方法：染色深则分化时间稍长些即可；染色浅则再置于苏木素中染色即可。盐酸酒精是分化，氨水是返兰，作用不同。片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返兰即可。

13）封片：为了长期保存，一般用中性树胶等封片。可直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。

 

2、免疫荧光方法中的重要环节

1）冰冻切片制备：建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。

2）组织切片固定：切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进行固定5-10min，尤其要较长时间保存的白片，一定要及时固定和适当保存。

3）血清封闭：为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清（与二抗来源一致）封闭，减弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的，一般10-30min。

4）一抗孵育条件：在免疫组化反应中，孵育时间和抗体浓度最重要。一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min，具体条件需要摸索。

5）二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度，切记要避光反应。但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。

6）复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位。一般常用DAPI复染。Merck Miliipore有一款即用型DAPI（code：S7113），其中DAPI是溶解在Antifade中，Antifade可以防止荧光信号过快地淬灭，从而得到较好的染色效果。

7）封片：为了长期保存，一般用缓冲甘油等封片。目前市场上多家公司都提供专门的抗荧光萃灭封片液，封闭效果很好。

8）切片清洗：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，一般在一抗孵育前清洗3min*3次，一抗孵育后的清洗均为5次*5min。

注意：

（1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。

（2）温柔冲洗，防止切片的脱落。

（3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。

（4）PBS的PH和离子强度的使用和要求：建议PH在7.4-7.6，浓度0.01M。中性及弱硷性条件（PH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解。

（5）拍照：有条件的话最好立即拍照，若不能及时拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度。使用荧光显微镜注意严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序；应在暗室中进行检查；防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜；检查时间每次以1-2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3-5min后，荧光也明显减弱或褪色；激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现象，所以最多不得超过2-3h；荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。灯熄灭后欲再启用时，须待灯光充分冷却后才能点燃。