Western Blot 常见问题及解决方案

 

大家都知道，Western Blot分为四个基本的步骤：样品制备—电泳—印迹—免疫检测。要想成功的完成Western Blot实验，每一步都很重要。

我们对Western Blot常见问题进行归类，总结出了以下几类。

下面一一阐述，首先来看Western Blot遇到的第一个问题——样品制备。

一、样品的常见问题

1.       如果目标蛋白是膜蛋白或胞浆蛋白，操作需注意什么？

解答：如果目标蛋白是膜蛋白或胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多。目前市面上有专门针对亚细胞组分的蛋白抽提试剂盒，可以高效的富集到活性蛋白。如默克密理博开发的相应的亚细胞组分抽提试剂盒。包括胞浆蛋白、膜蛋白、核蛋白以及细胞骨架蛋白。提取过程中不需要超高速离心及高温孵育，以较少起始材料就能获得足够量的高品质蛋白，以满足下游实验。

2.       处理组织样品有什么注意事项？

解答：组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性。许多公司，如默克密理博等都提供有蛋白酶抑制剂。

二、电泳转移的常见问题

1.       大分子量蛋白的转移效率低？

解答：（1）优化转移缓冲液；（2）转移缓冲液中加入20%甲醇，甲醇可以降低蛋白的洗脱效率，增加蛋白和膜的结合能力。（3）转移缓冲液中加入终浓度0.1% SDS。（4）提高转移电压/电流，增加转移时间。（4）选择优质的转移膜。默克密理博提供各种孔径大小的膜，蛋白吸附能力强，结合稳固，信号更强，不妨一试。

2.       膜、滤纸、胶大小有何讲究？

解答：滤纸的长宽分别比胶小1—2mm，而膜的长宽分别比胶大1—2mm。绝对禁忌：上下两层滤纸因为过大而相互接触，这样会导致短路。

三、检测结果中常见的问题

1.       背景过高？

解答：背景过高可能是由很多因素引起的：封闭不完全、显色过度、洗涤不充分、转移缓冲液或设备有污染、抗体稀释度不对或抗体不纯。

（1）       封闭不完全

一抗或二抗只要结合到膜上，就会显色。为了避免非特异性的结合，应用封闭液孵育膜，使所有的空白位点都被封闭蛋白占有。NC膜推荐封闭液是3%的明胶，室温孵育1小时。如果想要低温封闭的话，可以用3%的BSA。PVDF膜推荐的封闭液是5%的脱脂奶粉。

传统的牛奶/蛋白类封闭剂会形成较厚的、粘粘的蛋白层，导致与抗体发生非特异性相互作用，增加背景；另一方面，牛奶中本身含有的磷酸化蛋白会干扰蛋白磷酸化检测。Merck Millipore的BlФk®-CH封闭剂（目录号：WBAVDCH01）是一种无蛋白化学试剂，不会像牛奶一样在膜表面形成厚而粘稠的一层，可以显著降低背景，改善蛋白检测效果；而且性质非常稳定，室温可存放两年以上；洗去杂交信号后，可继续考染保存数据，不必额外跑一次电泳。

（2）       显色过度

显色时间的长短取决于蛋白条带的数目以及你想要的灵敏度。如果膜在显色液中放置太久，背景就会偏高。应当在蛋白条带清晰可见，而背景几乎没有或很少时，将膜及时取出。

（3）       洗涤不充分

在封闭以及抗体孵育之后，至少要洗两次膜，每次5分钟。去污剂的浓度不要太高，否则会把抗原从膜上洗下来。

（4）       转移缓冲液或设备污染

使用清洁剂将转印槽内外彻底清洗干净，海绵垫也一定要认真清洗，脏的海绵垫通常是污染的最主要原因。另外，每次转膜时的缓冲液都要是新鲜配制的。

（5）       抗体稀释度不正确

一抗的稀释度应根据抗体来源和经验来决定。一般来说，以1:100-1:1000来稀释血清或组织培养上清，以1:1000-1:10000来稀释腹水或超免疫动物的血清。抗体稀释度不够，会产生非特异的结合，带来高背景。重点推荐Merck Millipore的SignalBoost™免疫信号增强剂(目录号：407207-1KIT)，SignalBoost™作为抗体稀释液，在一抗、二抗孵育时增加了抗体与其反应表位的专一亲和力，从而增强信号强度。SignalBoost™与化学发光、荧光、显色等各种检测方法兼容。最重要的，使用SignalBoost™可以节省宝贵的抗体，仅需要常规western blot中抗体用量的10%即可获得同样强度的信号。

（6）       二抗不纯

没有交叉吸附过的二抗可能会与膜上的其他蛋白相互作用，产生杂带。这种情况可以选用单克隆的二抗。BD、Merck Millipore等都提供多种类型的高品质二抗。

2.       信号较弱？

解答：杂交信号弱也是由多方面因素造成的：

（1）       封闭剂不合适

封闭剂可能与目的蛋白有亲和性而干扰了检测。换用其他封闭剂或减少封闭剂的用量及孵育时间。

（2）       抗体失活或抗体浓度太低

抗体长期保存应在—70℃，使用前最好做效价检测；增加抗体浓度。

（3）       抗原不充足

抗原不充足也就是目的蛋白的量不够，应该适当增加蛋白的上样量，并且做已知标准量蛋白的对照。

（4）       膜漂洗过度

减少漂洗的时间和次数。

（5）       蛋白转移有问题

蛋白转移不充分，导致膜上的蛋白量很低，减弱了检测效果。应该优化蛋白转移操作过程，选用高品质的转印膜。

3.       出现非特异性条带？

（1）       一抗的特异性低/一抗浓度过高

重新选择一抗，尽量使用大品牌、高品质的单克隆一抗。推荐BD、Merck Millipore公司的一抗；增加一抗的稀释度。

（2）       二抗浓度过高/二抗出现非特异结合

增加二抗的稀释度；选择特异性强的二抗。

（3） 抗原量过高——减少蛋白上样量。