Western Blot 样品制备全攻略

 

样品制备是Western Blot的第一步，直接关系到所得目的蛋白的纯度和浓度，主要有以下两种方法：

（1）通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白

a.水溶液提取法：针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。

b.有机溶剂提取法：对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。

（2）通过层析或电洗脱法制备目的蛋白。

 

下面我们看看样的品制备的分类及需要注意的一些事项：

 

1. 不同来源样本的蛋白制备方法

（1）体液样品，如血清、血浆等

对于检测体液中的低丰度蛋白，有效的降低样品中蛋白组分的复杂性是关键，而高丰度蛋白（白蛋白和IgG）的去除是一大问题。一般方法很难从体液中高效、特异性去除白蛋白和IgG，白蛋白和IgG的残留直接影响下游目的蛋白的检测，造成假阳性。

默克密理博的ProteoExtract高丰度蛋白去除试剂盒（目录号：LSKMAGD12、LSKMAGD12-1）可以做到！另外，新推出的PureProteome磁珠版产品(目录号：LSKMAGL10)更是方便了小量样本的操作。

（2）原核细胞的蛋白抽提

以大肠杆菌为例，大肠杆菌一般采用超声破碎的方法。但是超声破碎有很多不足之处，超声破碎是一种很强的机械力，损伤蛋白的活性是一方面；破碎过程中产生的大量热量也会使目的蛋白降解。

默克密理博Novagen推出了Buster系列优化去污剂及其它成分的裂解抽提试剂，其中BugBuster(目录号：71456-3、70584-3)用于大肠杆菌蛋白抽提。这种新型抽提试剂能非常温和、高效地从目的细胞中制备可溶蛋白。

（3）酵母、植物细胞的蛋白抽提

你还在拿着研磨棒，边加液氮边吃力地研磨吗？既不方便，又严重的损伤蛋白，事半功倍！试试默克密理博的YeastBuster（目录号：71186-3），一步法抽提，保证蛋白活性的前提下，又方便了下游的纯化和分析。

（4）昆虫/哺乳动物细胞的蛋白抽提

超声、冻融等一系列激烈的细胞处理，步骤繁琐又损伤蛋白活性，间接降低有效蛋白的提取量。而默克密理博的CytoBuster（目录号：71009-3）中温和的非离子成分能够分离功能活性的内源或表达蛋白。

（5）亚细胞蛋白组分的抽提

亚细胞蛋白组分的抽提相对来说比较复杂，传统的方法既麻烦又耗时，关键在于很难高效富集到活性蛋白。针对不同的细胞器，默克密理博开发了相应的亚细胞组分抽提试剂盒（目录号：539790-1KIT、71771-3）。包括胞浆蛋白、膜蛋白（目录号：71772-3、444810-1KIT）、核蛋白（目录号：2900、71183-3）以及细胞骨架蛋白（目录号：17-10195、17-10210）。提取过程中不需要超高速离心及高温孵育，以较少起始材料就能获得足够量的高品质蛋白，以满足下游实验。

2.核酸的去除

样本中若残留核酸，往往会对蛋白研究产生干扰，所以应该尽量将核酸去除干净。一般的方法很难把所有形式的DNA和RNA（单链、双链、线形和环状）去除，而且去除过程中增加了样品的粘度，直接影响下游实验。针对这类问题，默克密理博推出了Benzonase核酸酶（目录号：70664-3、70746-3、71205-3、71206-3），这种全能酶可以降解所有形式的核酸，迅速降低样本粘度，增加蛋白产量。

3.蛋白酶的抑制

内源性和外源性的蛋白酶可以在细胞或组织裂解后迅速降解蛋白。而蛋白的水解降低了蛋白的量和活性。为了避免蛋白水解，通常会加入蛋白酶抑制剂，但是仍然不能起到彻底的抑制效果。默克密理博的蛋白酶抑制剂（目录号：539134-1ML、539134-1SET）是一种混合物，可以全面、稳定的抑制各种蛋白酶的活性使单边样品保持完整，保证下游蛋白分析和复杂蛋白研究。

4.磷酸酶的抑制

在磷酸化蛋白的提取过程中，内源性的蛋白磷酸酶会去除磷酸基团，使蛋白恢复到去磷酸化状态。为了保持目的蛋白的磷酸化状态，必须抑制蛋白磷酸酶的活性。默克密理博的磷酸酶抑制剂混合物（目录号：524625-1SET、524629-1ML、524629-1SET）可以全面、稳定的达到这种抑制效果。另外，PhosphoSafe磷酸化蛋白专用试剂盒也非常有效。

5.免疫沉淀

纯化天然构象的蛋白或变性蛋白，免疫沉淀是很好的选择。但常规的免疫沉淀又存在许多问题，比如操作时间很长，过程很繁琐，最后纯化的效果也不一定很好。这时，您可以试试默克密理博的Catch and Release可逆免疫沉淀试剂盒(目录号：17-500、17-500A、17-501、17-502)，最短30分钟可以完成IP的孵育过程，非常快速，而且采用了特别的抗体捕获亲和配体（ACAL），大大降低了非特异性结合。

6.重组表达蛋白的纯化

为了特异地从复杂背景中分离目的分子，或者制备蛋白用于相互作用分析，或者从某个反应中去除某种分子等，亲和纯化技术是个不错的选择。

目前包括BD在内的许多公司都提供有商品化的纯化试剂盒。BD公司可提供用于带有6×His、GST融合标签的重组蛋白的纯化试剂盒，省时省力。默克密理博的产品种类更全，包括用于大肠杆菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞表达的带有His、GST、S、Strep、HSV、Nus、T7等各种融合标签的重组蛋白的纯化和分析产品（目录号：70239-3、70541-3）。每一种融合纯化和检测，Novagen都提供多种产品和试剂盒形式，毫升级到升级、单个样本或高通量，总有一款默克密理博纯化产品适合你！

7.样品超滤浓缩

在蛋白样品的制备过程中，往往含有高盐及其他小离子成分，而且蛋白是被稀释的，需要对所得蛋白样品进行浓缩和去盐。超滤是不错的选择，所以多种多样的超滤管问市。在众多公司中，默克密理博的Amicon Ultra超滤管（目录号：UFC905096(常用规格)）一直以其优良的质量和不断的创新，成为行业标杆。Amicon Ultra的4种超滤管可以浓缩4种不同大小的蛋白。Amicon Ultra设计灵巧，死体积设计可以防止过度离心而导致样本过干；反转离心回收设计保证了最大的回收率；垂直结构的竖膜设计避免堵膜，在短时间内即可完成浓缩、去盐和换缓冲液；并且化学兼容性宽泛，样品绝不会渗漏，是您不错的选择！

8.样品透析

    制备的蛋白样品中含有小分子物质。这些小分子物质（无机盐、糖等）可以自由通过透析膜与周围的缓冲溶液进行溶质交换，进入到透析液中。而蛋白质是大分子物质，它不能透过透析膜，所以就与小分子物质分离开来。传统的透析方法是采用透析袋，这种方法耗时长，甚至过夜，而且透析不彻底。现在来试试默克密理博的D-tube透析管和电洗脱管，操作起来更方便，减少了样品污染和损失，2-5小时完成透析，效率大大提高。