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Western Blot 样品制备全攻略

发布日期:2012-10-29  浏览次数:2487  

Western Blot 样品制备全攻略

Western Blot 样品制备全攻略

 

样品制备是Western Blot的第一步,直接关系到所得目的蛋白的纯度和浓度,主要有以下两种方法:

1)通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白

a.水溶液提取法:针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂

b.有机溶剂提取法:对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取,包括乙醇、丙酮和丁醇等。

2)通过层析或电洗脱法制备目的蛋白。

 

下面我们看看样的品制备的分类及需要注意的一些事项:

 

1. 不同来源样本的蛋白制备方法

1)体液样品,如血清、血浆等

对于检测体液中的低丰度蛋白,有效的降低样品中蛋白组分的复杂性是关键,而高丰度蛋白(白蛋白和IgG)的去除是一大问题。一般方法很难从体液中高效、特异性去除白蛋白和IgG,白蛋白和IgG的残留直接影响下游目的蛋白的检测,造成假阳性。

默克密理博的ProteoExtract高丰度蛋白去除试剂盒(目录号:LSKMAGD12LSKMAGD12-1可以做到!另外,新推出的PureProteome磁珠版产品(目录号:LSKMAGL10)更是方便了小量样本的操作。

2)原核细胞的蛋白抽提

以大肠杆菌为例,大肠杆菌一般采用超声破碎的方法。但是超声破碎有很多不足之处,超声破碎是一种很强的机械力,损伤蛋白的活性是一方面;破碎过程中产生的大量热量也会使目的蛋白降解。

默克密理博Novagen推出了Buster系列优化去污剂及其它成分的裂解抽提试剂,其中BugBuster(目录号:71456-370584-3)用于大肠杆菌蛋白抽提。这种新型抽提试剂能非常温和、高效地从目的细胞中制备可溶蛋白。

3)酵母、植物细胞的蛋白抽提

你还在拿着研磨棒,边加液氮边吃力地研磨吗?既不方便,又严重的损伤蛋白,事半功倍!试试默克密理博的YeastBuster(目录号:71186-3,一步法抽提,保证蛋白活性的前提下,又方便了下游的纯化和分析。

4)昆虫/哺乳动物细胞的蛋白抽提

超声、冻融等一系列激烈的细胞处理,步骤繁琐又损伤蛋白活性,间接降低有效蛋白的提取量。而默克密理博的CytoBuster(目录号:71009-3中温和的非离子成分能够分离功能活性的内源或表达蛋白。

5)亚细胞蛋白组分的抽提

亚细胞蛋白组分的抽提相对来说比较复杂,传统的方法既麻烦又耗时,关键在于很难高效富集到活性蛋白。针对不同的细胞器,默克密理博开发了相应的亚细胞组分抽提试剂盒(目录号:539790-1KIT71771-3。包括胞浆蛋白、膜蛋白(目录号:71772-3444810-1KIT)、核蛋白(目录号:290071183-3)以及细胞骨架蛋白(目录号:17-1019517-10210。提取过程中不需要超高速离心及高温孵育,以较少起始材料就能获得足够量的高品质蛋白,以满足下游实验。

2.核酸的去除

样本中若残留核酸,往往会对蛋白研究产生干扰,所以应该尽量将核酸去除干净。一般的方法很难把所有形式的DNARNA(单链、双链、线形和环状)去除,而且去除过程中增加了样品的粘度,直接影响下游实验。针对这类问题,默克密理博推出了Benzonase核酸酶(目录号:70664-370746-371205-371206-3,这种全能酶可以降解所有形式的核酸,迅速降低样本粘度,增加蛋白产量。

3.蛋白酶的抑制

内源性和外源性的蛋白酶可以在细胞或组织裂解后迅速降解蛋白。而蛋白的水解降低了蛋白的量和活性。为了避免蛋白水解,通常会加入蛋白酶抑制剂,但是仍然不能起到彻底的抑制效果。默克密理博的蛋白酶抑制剂(目录号:539134-1ML539134-1SET是一种混合物,可以全面、稳定的抑制各种蛋白酶的活性使单边样品保持完整,保证下游蛋白分析和复杂蛋白研究。

4.磷酸酶的抑制

在磷酸化蛋白的提取过程中,内源性的蛋白磷酸酶会去除磷酸基团,使蛋白恢复到去磷酸化状态。为了保持目的蛋白的磷酸化状态,必须抑制蛋白磷酸酶的活性。默克密理博的磷酸酶抑制剂混合物(目录号:524625-1SET524629-1ML524629-1SET可以全面、稳定的达到这种抑制效果。另外,PhosphoSafe磷酸化蛋白专用试剂盒也非常有效。

5.免疫沉淀

纯化天然构象的蛋白或变性蛋白,免疫沉淀是很好的选择。但常规的免疫沉淀又存在许多问题,比如操作时间很长,过程很繁琐,最后纯化的效果也不一定很好。这时,您可以试试默克密理博的Catch and Release可逆免疫沉淀试剂盒(目录号:17-50017-500A17-50117-502),最短30分钟可以完成IP的孵育过程,非常快速,而且采用了特别的抗体捕获亲和配体(ACAL),大大降低了非特异性结合。

6.重组表达蛋白的纯化

为了特异地从复杂背景中分离目的分子,或者制备蛋白用于相互作用分析,或者从某个反应中去除某种分子等,亲和纯化技术是个不错的选择。

目前包括BD在内的许多公司都提供有商品化的纯化试剂盒。BD公司可提供用于带有6×HisGST融合标签的重组蛋白的纯化试剂盒,省时省力。默克密理博的产品种类更全,包括用于大肠杆菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞表达的带有HisGSTSStrepHSVNusT7等各种融合标签的重组蛋白的纯化和分析产品(目录号:70239-370541-3。每一种融合纯化和检测,Novagen都提供多种产品和试剂盒形式,毫升级到升级、单个样本或高通量,总有一款默克密理博纯化产品适合你!

7.样品超滤浓缩

在蛋白样品的制备过程中,往往含有高盐及其他小离子成分,而且蛋白是被稀释的,需要对所得蛋白样品进行浓缩和去盐。超滤是不错的选择,所以多种多样的超滤管问市。在众多公司中,默克密理博的Amicon Ultra超滤管(目录号:UFC905096(常用规格)一直以其优良的质量和不断的创新,成为行业标杆。Amicon Ultra4种超滤管可以浓缩4种不同大小的蛋白。Amicon Ultra设计灵巧,死体积设计可以防止过度离心而导致样本过干;反转离心回收设计保证了最大的回收率;垂直结构的竖膜设计避免堵膜,在短时间内即可完成浓缩、去盐和换缓冲液;并且化学兼容性宽泛,样品绝不会渗漏,是您不错的选择!

8.样品透析

    制备的蛋白样品中含有小分子物质。这些小分子物质(无机盐、糖等)可以自由通过透析膜与周围的缓冲溶液进行溶质交换,进入到透析液中。而蛋白质是大分子物质,它不能透过透析膜,所以就与小分子物质分离开来。传统的透析方法是采用透析袋,这种方法耗时长,甚至过夜,而且透析不彻底。现在来试试默克密理博的D-tube透析管和电洗脱管,操作起来更方便,减少了样品污染和损失,2-5小时完成透析,效率大大提高。

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